Археоботаническое и молекулярное исследование семян из кургана № 2 могильника Каратобе

Описание археологических материалов. Могильник Каратобе расположен у северозападного подножия горы Кокентау в Жанасемейском районе области Абай. Памятник открыт Семейским отрядом Восточно-Казахстанской экспедиции в 2014 г. Археологические исследования на этом памятнике произведены впервые соавторами данной статьи А. Айткали и А. Жунисхановым (Айткали и др. 2014: 152—153, Aitkali et al. 2023: 85—90).

Могильник образован тремя курганными группами, насчитывающими 17 объектов. Они вытянуты по линии север—юг. Всего изучено пять курганов (Айткали и др. 2014:, Исин и др. 2018: 107—110). Насыпи курганов однотипны, состояли преимущественно из камней вперемешку с землей. Диаметр их не превышал 17 м. Внешнее кольцо (кромлех) чётко выступало над современной поверхностью земли. Между кромлехом и насыпью конструктивные элементы отсутствовали. С северо-восточной стороны каменного кольца фиксировался вход, образованный двумя аккуратно положенными крупными камнями в разрыве кольца (Айткали и др. 2014: 151). Могильные ямы всех исследованных курганов орентированы длинной осью по направлению восток—запад. Внутримогильные сооружения представлены в одном случае каменным ящиком, в остальных — грунтовой ямой с заставкой из вертикально поставленных плит, погребённые уложены на спину, головой ориентированы на запад и юго-запад. Из исследованных пяти курганов один — № 6 — с «усами» (Исин и др. 2018: 108).

В данной статье рассматриваются семена, обнаруженные при изучении кургана № 2. Материалы, полученные при его раскопках, опубликованы ранее (Айткали и др. 2014; Aitkali et al. 2023). Семена выявлены у южной стенки каменного ящика. Растительные остатки представлены семенами растений, предположительно относящихся к семейству Polygonaceae .

С целью определения хронологических рамок погребального памятника отобраны образцы человеческих костей и семян для радиоуглеродного датирования. Анализы проводились в лаборатории масс-спектрометрии Центр физических наук и технологий (г. Вильнюс, Литва). Результаты радиоуглеродного анализа имеют следующие значения: для костей человека — 2284 ± 26 ¹⁴C BP, для семян — 297 ± 26 ¹⁴C BP (табл. 1).

Семена растений в погребальных памятниках обнаруживаются часто. Но исследователи не всегда проводят радиоуглеродные анализы семян. Так, например, при изучении кургана Уржар (Тасарык) с женским погребением, выявленным в 2013 г. в ходе охранных работ, были обнаружены кроме человеческих останков и погребального инвентаря скопления растительных остатков. Среди них: плоды конопли ( Cannabis ), щавеля ( Rume ), дриады восьми-лепестной ( Drýas octopétala ), горца птичьего ( Polygonum aviculare ), триостренника болотного ( Triglоchin palиstris ), смолевки обыкновенной ( Silene ), кориандра ( Anéthum ), зиры ( Cumīnum cymīnum ), авра_́на ( Gratiola officinalis ), чертополоха ( Carduus acantoides ), хвои, подорожника и большое количество семян злаков (Байтанаев 2019: 9, 16)¹. Радиоуглеродный анализ из этого комплекса сделан по фрагменту сохранившегося дерева из погребального

МАИАСП № 21. 2025

Археоботаническое и молекулярное исследование семян из кургана № 2 могильника Каратобе предметного комплекса. В заключение автор статьи допускает мысль, о том что лечебные травы специально принесены, погребённый человек мог быть при жизни лекарем-жрецом (Байтанаев 2019: 17—19).

Целью исследований материала из кургана № 2 мог. Каратобе является регенерация растений из семян, их видовая идентификация. В предварительных экспериментах предприняты попытки прорастить семена обычным способом на увлажнённом субстрате в сосудах с почвой и чашках Петри, с использованием стратификации при +4°С и обработкой стимуляторами роста (гибберелловой кислотой). Но эти исследования оказались безрезультатными: ни одно из семян не проросло. В связи с этим были предприняты попытки получить растения с использованием культуры in vitro .

Материалы

Материалом для исследований послужили семена, предположительно принадлежащих виду из семейства Гречишных ( Polygonaceae ). Растительный материал по форме представляет собой трёхгранные плоды размерами 1—2 × 0,3—0,5 мм, похожие на плоды гречихи, очень плотные и твёрдые, чёрного цвета (рис. 1)².

Рис. 1. Внешний вид зёрен растительных остатков из кургана № 2 могильника Каратобе.

Fig. 1. Morphology of plant macroremains (seeds) from Kurgan No. 2 of the Karatobe burial site.

Р.Н. Календарь, О.Н. Хапилина, А.Т. Кулыясов, А.С. Жунисханов, А.И. Исин, А.К. Айткали

МАИАСП № 21. 2025

Методы исследований

Культура in vitro. Для получения проростков в культуре in vitro отработано несколько вариантов стерилизации семян. Протокол № 1 состоял в обработке 70% этанолом в течение двух минут с последующей промывкой дистиллированной водой, затем 15% хлорамином в течение 20 минут с последующей промывкой стерильной дистиллированной водой (Калашникова 2004). Протокол № 2 состоял в стерилизации семян 0,1% раствором хлористой ртути в течение 15 минут с последующей промывкой стерильной водой, затем материал помещали в пакеты из фильтровальной бумаги, после чего помещали в раствор 0,1% гибберелловой кислоты (GA3). Чашки с увлажнёнными пакетами помещали в холодильник с температурой +5°С на пять дней для стратификации. После стратификации семена, не разрушая целостности пакетов, стерилизовали в 0,1% растворе хлористой ртути в течение 15 минут с последующей тщательной промывкой стерильной водой три раза по 20 минут (Способ получения 2016). Протокол № 3 проводили аналогично протоколу № 2, но после пост-стратификационной стерилизации в растворе хлористой ртути семена помещали в каплю концентрированной серной кислоты на 1—2 минуты (рис. 2), затем тщательно промывали стерильной водой (Барсукова 2016).

Поверхностно стерилизованные семена помещали на поверхность питательной среды, содержащей ½ нормы минеральных солей по прописи Мурасиге и Скуга (Murashige, Skoog 1962), 5 мг/л гибберелловой кислоты и 20 г/л сахарозы. Культивирование проводили в световой комнате при освещении светодиодными лампами Phytoflora.

Рис. 2. Стерилизация семян растений из кургана № 2 могильника Каратобе в концентрированной серной кислоте.

МАИАСП Археоботаническое и молекулярное исследование семян ₁₃₆ № 21. 2025 из кургана № 2 могильника Каратобе

Выделение тотальной ДНК из зёрен

Экстракцию ДНК проводили из проростков методом с использованием кислого лизирующего СТАВ-HEPES буфера (1.5% CTAB, 1.5 M NaCl, 10 mM Na 3 EDTA, 50 mM HEPES, pH 5.3), по протоколу компании PrimerDigital (Total DNA isolation protocol, PrimerDigital, дата обращения: 16.09.2025). Качественные и количественные показатели ДНК определяли с использованием гель-электрофореза и спектрофотометра NanoDrop.

Экстрагированную ДНК визуализировали с использованием системы гель-документации ChemiDoc-It®TS2 Imager (UVP), для чего проводили горизонтальный электрофорез в 1%-ном агарозном геле, помещенном в камеру с 1хTAE-буфером (40 мМ Tris-CH 3 COOH, pH 8.0). Электрофорез проводили при постоянном напряжении 80 V, в течение 150 минут. В качестве маркера молекулярных масс (М) использовали GeneRuler DNA Ladder Mix (100—10,000 bp) (#SM0332, Thermo Fisher Scientific) (рис. 3).

Рис. 3. Электрофорез выделенной ДНК из индивидуальных зерён растений из кургана № 2 могильника Каратобе.

Р.Н. Календарь, О.Н. Хапилина, А.Т. Кулыясов, А.С. Жунисханов, А.И. Исин, А.К. Айткали

МАИАСП № 21. 2025

Слева, маркера молекулярных масс (GeneRuler DNA Ladder Mix: 100—10,000 п.н.) и 10 образцов ДНК из индивидуальных зёрен.

ПЦР анализ с использованием PBS праймеров

Для проведения ПЦР амплификации для ДНК-фингерпринта использовали реакционную смесь в объёме 25 мкл следующего состава: ДНК 25 нг, 1x DreamTaq буфер (содержащий 1.5 mM MgCl 2 ), 1µM праймер, 200µM dNTP, 1 U Dream Taq ДНК полимеразы (Thermo Fisher Scientific). Режим амплификации был следующим: предварительная денатурация при 95°С в течение двух минут, затем 32 цикла: 15 сек — 95 ° C, 30 сек — 50 ° C и 90 сек — 72 ° C; последняя элонгация — две минуты при 72 ° C.

Результаты оценивали в 1.2%-м агарозном геле в 1x THE (20 mM Tris-HEPES, pH 8.06), в присутствии бромистого этидия, с использованием системы гель-документации ChemiDoc-It®TS2 Imager (UVP). Электрофорез проводили при постоянном напряжении 70 V в течение четырёх часов.

Приготовление образцов для хромато-тандемной масс спектрометрии LC-MS/MS

Несколько зёрен (3—4) перенесли в микропробирку на 1.5 мл и добавили 50 мкл свежеприготовленного раствора 8 М мочевины в 0,1 М Tris-HCl (pH 8.5). Содержимое пробирок интенсивно размельчали с помощью пестика в течение 3—4 минут. После вортексирования и откручивания на настольной центрифуге при максимальной скорости, верхнюю фазу (экстракт), содержащую белки отобрали и использовали на следующих этапах.

Белковую фракцию в объеме 30 мкл смешали с 10 мкл буферного раствора NuPAGE LDS Sample buffer (Invitrogen, NP0007), содержащего 10% меркаптоэтанола. Смесь инкубировали при 98 ° C в течение трёх минут и вносили на готовый градиентный гель NuPAGE 4-12% BisTris gradient precast gel (Invitrogen NP0321BOX).

Белковые полосы вырезали из геля и обработали согласно протоколу, описанному ранее в литературе (Калашникова 2004). Кусочки геля дегидратировали добавлением 300 мкл 50% ацетонитрила с последующим добавлением 300 мкл 100% ацетонитрила, а затем регидратировали добавлением 300 мкл 50 мМ бикарбоната аммония. Конечную дегидратацию проводили двухкратной промывкой 300 мкл 50% ацетонитрила и 300 мкл 100% ацетонитрила. Каждую промывку проводили 10 минут при скорости встряхивания 1400 rpm и 25 ° C. Затем кусочки геля высушили на вакуумном концентраторе SpeedVac при 35 ° C в течение 30 минут. Для проведения протеолитического расщепления, кусочки геля преинкубировали с 10 мкл раствора трипсина с концентрацией 13.33 нг/мл (Pierce, 90057) при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем в пробирку добавили 25 мкл 50 мМ раствора бикарбоната аммония и кусочки геля инкубировали 16 часов при 37 ° C. Полученную смесь пептидов очищали с помощью набора Zip tip (Pierce C18 Tips, 10 µL bed, 87782). Очищенную смесь пептидов высушили на вакуумном концентраторе SpeedVac при 35 ° C в течение 30 минут, а затем ресуспендировали в 10 мкл раствора с 0.1% трифторуксусной кислоты (TFA).

В экспериментах использовали улавливающую колоночную систему (Acclaim PepMap100 C18 pre-column, 5 mm×300 mm; 5 mm particles; Thermo Fisher Scientific) с насосом для ВЭЖХ от компании Dionex (Ultimate 3000 RSLCnano System, Thermo Fisher Scientific). Смесь пептидов разделяли на колонке Acclaim Pep-Map RSLC column (15 cm×75 mm, 2 mm particles; Thermo Scientific) с использованием 75-минутного многошагового градиента ацетонитрила (буфер A: раствор муравьиной кислоты (0.1%); буфер B: 90% ацетонитрил, 10% раствора муравьиной кислоты (0.1%)) при скорости потока 0.3 мкл/мин. Временной график процесса: 0 мин — 2% B, 10 мин — 2% B, 58 мин — 50% B, 59 мин — 99%, 69 мин — 99%, 70 мин — 2.0%, 75 мин — 2.0%. Немодифицированный источник CaptiveSpray

МАИАСП № 21. 2025

Археоботаническое и молекулярное исследование семян из кургана № 2 могильника Каратобе

(Капилляр 1300 В, сухой газ 3.0 л/мин, температура высушивания 150 ° C) использовали для интерфейса системы ВЭЖХ с масс спектрометром Impact II (Bruker). Для накопления данных от образца, программа выбирала для фрагментации два наиболее интенсивных ионов прекурсоров, в результате чего общее время цикла составило 3 секунды. Диапазон масс MS-скана был установлен в интервале m/z от 150 до 2200 в режиме положительных ионов.

Программный продукт Mascot использовали для проведения поиска по базе данных SwissProt 2014_08 database (546,238 сиквенсов; 194,363,168 остатков), а также по обновленной базе данных SwissProt 2016_10 (552,884 сиквенсов; 197,760,918 остатков). Параметры поиска: вариабельные модификации окисление метионина (M), допуск масс фрагментного иона, 20 ppm; допуск масс родительского иона, 20 ppm.

Результаты

Культура in vitro семян из предполагаемого семейства Polygonaceae. Выбор оптимального протокола был основан на таких критериях, как отсутствие инфицированных эксплантов, а также сохранение жизнеспособности семян. Изучение различных протоколов стерилизации показало, что стандартный протокол, используемый для большинства растительных материалов, не подходит для данных образцов. По истечении недели культивирования экспланты были инфицированы плесневыми грибами. При использовании протоколов № 2 и 3 отмечали стерильность эксплантов, при этом на отдельных эксплантах было отмечено прорастание (табл. 2). Всего было получено четыре полноценных проростка, два из которых имеют укороченые междоузлия, у двух — междоузлия несколько растянуты. Удлинённые междоузлия возможно обусловлены воздействием гибберелловой кислоты.

Два проросших семени, у которых было отмечено формирование первичного корешка, остановили своё развитие. Все выжившие проростки имели антоциановую окраску гипокотиля, которая исчезала по мере появления настоящих листьев (рис. 4, 5).

Рис. 4. Появление зародышевого корня на отдельных эксплантах (3 день культивирования).

Fig. 4. Emergence of the Embryonic Root on Individual Explants (Day 3 of Cultivation).

139                   Р.Н. Календарь, О.Н. Хапилина, А.Т. Кулыясов,                   МАИАСП

А.С. Жунисханов, А.И. Исин, А.К. Айткали                    № 21. 2025

Рис. 5. Стерильные проростки, полученные из семян через семь дней культивирования (осень 2017).

Fig. 5. Sterile Seedlings Obtained from Seeds after 7 Days of Cultivation (Autumn 2017).

У проростков в возрасте 21 день сформирован слабый стелющийся стебель длиной 4—6 см, который имеет 2—3 междоузлия, с очередным расположением листьев, листья тонко ланцетовидные, гладкие, блестящие, без опушения, без прилистников, длиной 2—3 см. Корневая система развита слабо, у проростков наблюдали от одного до пяти нитевидных корней. Для дальнейшего роста и развития проростки были помещены на среду с повышенным содержанием цитокининовых фитогормонов (ВАР и кинетин). В настоящий момент проростки культивируются в маджента-боксах (рис. 6) и получены растения с хорошо сформированной корневой системой (рис. 7).

Рис. 6. Культивирование проростков Polygonum aviculare L. на среде для индукции органогенеза (январь 2018).

Fig. 6. Cultivation of Polygonum aviculare L. seedlings on medium for organogenesis induction (January 2018).

МАИАСП № 21. 2025

Археоботаническое и молекулярное исследование семян из кургана № 2 могильника Каратобе

Рис. 7. Культивирование растений на среде для получение полноценного растения горца ( Polygonum aviculare L. ) (август 2018).

Fig. 7. Cultivation of plants on medium for obtaining a complete knotgrass ( Polygonum aviculare L. ) (August 2018).

Клонирование и анализ рибосомальных 18S и 23S генов

Для определения видовой принадлежности семян из кургана № 2 проведено клонирование и секвенирование фрагмента участка гена18S рибосомальной РНК из выделенной из семян ДНК. Для анализа и амплификации участков генов 18S рибосомальной РНК (рРНК) и 23S использовали универсальные праймеры (табл. 3).

ПЦР амплификацию проводили для комбинаций праймеров, которые амплифицируют участки ITS между генами рРНК 18S и 23S, а также только для гена 18S рРНК. Полученные фрагменты амплификации представлены на рисунке 8. ПЦР амплификация участков ITS между 18S и 23S генами рРНК выявили две полосы (рис. 8: слот 1 и 2), где полоса большей

Р.Н. Календарь, О.Н. Хапилина, А.Т. Кулыясов, А.С. Жунисханов, А.И. Исин, А.К. Айткали

МАИАСП № 21. 2025

массы соответствует растительной ДНК, а полоса меньшей соответствует наличию ДНК грибов. Фрагмент для гена 18S рРНК давал одну полосу, соответствующую только растительному фрагменту этого гена. ПЦР фрагмент для гена 18S рРНК был секвенирован. Анализ полученных после секвенирования последовательностей ДНК для гена 18S рРНК проводили с помощью онлайн программы BLAST. Получали список растений семейства Гречишных с максимальной гомологией. Достоверным свидетельством того, что фрагмент принадлежит определенному виду, считали совпадение его нуклеотидной последовательности 18S рРНК с последовательностью 18S рРНК, представленной в банке NCBI, более чем на 97%. Наибольшую гомологию данный фрагмент последовательности 18S рРНК соответствовал горцу птичьему ( Polygonum aviculare L. ).

Рис. 8. ПЦР амплификация ДНК из зерна растения горца (Polygonum aviculare L. ) с помощью ПЦР праймеров: 1 — ПЦР продукт в 733 п.н. для амплификации ITS региона (праймеры 2943— 2944); 2 — ПЦР продукт в 749 п.н. для амплификации ITS региона (праймеры 2949—2944); 3 — ПЦР продукт в 501 п.н. для 18S rRNA гена (праймеры 3173—3174); 4 — Мультиплексный ПЦР с праймерами 1—3.

Fig. 8. PCR amplification of DNA from knotgrass (Polygonum aviculare L. ) grain using PCR primers: 1 — PCR product of 733 bp for amplification of the ITS region (primers 2943—2944); 2 — PCR product of 749 bp for amplification of the ITS region (primers 2949—2944); 3 — PCR product of 501 bp for the 18S rRNA gene (primers 3173—3174); 4 — Multiplex PCR with primers 1—3.

МАИАСП № 21. 2025

Археоботаническое и молекулярное исследование семян из кургана № 2 могильника Каратобе

Изучение молекулярно-генетического полиморфизма семян горца

Для выявления внутривидового полиморфизма, мы использовали универсальные ПЦР праймеры комплементарные PBS (Primer Binding Site) последовательностям ретротранспозонов.

Амплификации ДНК между PBS последовательностями, универсальный и эффективный метод, как для непосредственной визуализации полиморфизма между образцами, так и для полиморфизма в транскрипционных профилях, а также для быстрого клонирования сегментов LTR (Long Terminal Repeat) из геномной ДНК и алгоритма поиска по базе данных LTR-ретротранспозонов. Данный метод iPBS-амплификации основан на фактически универсальном присутствии тРНК-комплекса в качестве сайта связывания праймеров с обратной транскриптазой как в ретровирусах, так и в LTR-ретротранспозонах, что необходимо для инициации обратной транскрипции во время цикла репликации. Высококонсервативные PBS последовательности характерны для различных семейств LTR ретротранспозонов, и поскольку тРНК связывается с PBS-областью для инициации обратной транскрипции, последовательность этого региона комплементарна последовательности 3'-конца тРНК. Высокая степень информативности используемых ПЦР праймеров обусловлена повсеместным распространением последовательностей ретротранспозонов по всем хромосомам, включая кодирующие участки и гетерохроматин, за исключением теломерных и центромерных участков хромосом. ДНК фингерпринт на основе PBS технологии амплификации является наиболее быстрым и экономически более выгодным способом идентификации биологического материала, ввиду охвата значительного числа локусов на различных участках хромосом (гены, повторы, структурный хроматин и т.д.).

Последовательности используемых праймеров, комплементарных PBS участкам для ретротранспозонов представлены в таблице 3. Критериями эффективности используемых праймеров являлись равномерность насыщения спектров амплификации, а также индекс детектируемого полиморфизма. Праймеры, генерировавшие мало ПЦР-продуктов были отброшены, также были исключены праймеры, которые при хорошем насыщении спектров давали в основном мономорфные продукты.

ПЦР амплификация для ДНК из индивидуальных зерен горца (Polygonum aviculare L. ) с PBS праймерами показали, что используемые PBS праймеры являются высокоэффективными для детекции полиморфизма между индивидуальными образцами семян. Количество выявленных полиморфных локусов более чем достаточно для дифференциации исследуемых индивидуальных генотипов зерен, которые отличались уникальным сочетанием полиморфных амплифицированных фрагментов различного молекулярного веса. Размеры амплифицированных ПЦР фрагментов варьировали от 150 до 4000 п.н. Размеры и количество амплифицированных фрагментов, характер их распределения в спектрах различных видов бобовых, является индивидуальным и неповторимым для каждого генотипа (рис. 9). Внутривидовой полиморфизм (между индивидуальными семенами), выявляемый с использованием PBS праймеров может достигать 40—60%. Это очень высокий показатель внутривидовой изменчивости, так как количество полиморфных полос достигало до 50% из общего числа полос для восьми исследуемых зёрен, при которых не было выявлено одинаковых генотипа. Таким образом, семена из коллекции кургана № 2, показывали высокую степень гетерогенности при использовании PBS праймеров, характерную для неселекционных форм растений.

143                   Р.Н. Календарь, О.Н. Хапилина, А.Т. Кулыясов,                   МАИАСП

А.С. Жунисханов, А.И. Исин, А.К. Айткали                    № 21. 2025

Рис. 9. ДНК фингерпринт индивидуальных зёрен горца (Polygonum) (1—8) с использованием универсальных PBS ПЦР праймерами из кургана № 2 мог. Каратобе.

Fig. 9. DNA fingerprinting of individual knotweed (Polygonum) seeds (1—8) with universal PBS PCR primers, Kurgan No. 2, Karatobe burial site.

Хромато-тандемная масс спектрометрия (LC-MS/MS) запасных белков зерна

Для определения видовой принадлежности зёрен, помимо применения секвенирования 18S рРНК генов был также использован метод хромато-тандемной масс спектрометрии. На рисунке 10 показан электрофорез в ПАА геле тотальных белков из семян растений. Были вырезаны две полосы из геля, фрагмент, соответствующий массе ~39 кДа, который идентифицировали как белок 13S globulin seed storage protein из вида Fagopyrum esculentum (пептиды LTASEPSR и LTASEPSRR имеющие величины уровня достоверности Scores 36 и 47 соответственно). Второй фрагмент, соответствующий массе ~25 кДа, также идентифицирован как белок 13S globulin seed storage protein из Fagopyrum esculentum (пептид NAILGPR имеющий величину уровня достоверности Scores 35). Величины уровня достоверности были низкими, но они были выше минимального порога, составляющего величину 32. Поскольку молекулярная масса белка составляет 64.5 кДа и оказалась равной сумме масс этих двух бэндов, мы предполагаем, что образец содержал продукты деградации запасного белка (13S globulin seed storage protein). Повторное сравнение данных эксперимента с уже расширенной базой белков (в варианте SwissProt 2016_10 на 6646 сиквенсов больше, чем в старой версии 2014_08) показал идентичный результат.

МАИАСП № 21. 2025

Археоботаническое и молекулярное исследование семян из кургана № 2 могильника Каратобе

Рис. 10. Электрофорез белков зерна. Показаны участки вырезания из геля двух кусочка из геля, соответствующих массам ~39 кДа и 25 кДа.

Fig. 10. Electrophoresis of grain proteins. Sections corresponding to ~39 kDa and 25 kDa were excised from the gel.

Заключение

Результаты проведённых исследований показывают, полученные семена неизвестного происхождения принадлежат горцу птичьему (Polygonum aviculare L. ) . Данные были получены с использованием нескольких подходов: первый — секвенирование универсальных последовательностей рибосомальных генов (18S и 23S), второй — использование масс-спектрометрического анализа запасных белков из зёрен. Выделение тотальной ДНК и РНК показывает, что семена отлично сохранились, так как качество РНК идеальное. Поэтому, семена были подготовлены для культуры in vitro для получения полноценного растения. Получены жизнеспособные регенераты из семян. Некоторые дали полноценное растение спустя некоторое время культивирования в культуре in vitro

Р.Н. Календарь, О.Н. Хапилина, А.Т. Кулыясов, А.С. Жунисханов, А.И. Исин, А.К. Айткали

МАИАСП № 21. 2025

с гормонами роста. В результате получено несколько жизнеспособных растений, которые дали корни, и растение выглядело как современный горец птичий.

Проведён молекулярно-генетический полиморфизм индивидуальных семян горца. Эффективное выделение ДНК проведено с использованием кислого CTAB буфера. Качество ДНК позволило проведение ДНК-фингерпритного анализа индивидуальных семян с использованием универсальных к ретротранспозонам PBS праймеров. Внутривидовой полиморфизм (между индивидуальными семенами), выявляемый с использованием PBS праймеров достигал до 40—60%. Это очень высокий показатель внутривидовой изменчивости для восьми исследуемых зёрен, у которых не было выявлено двух одинаковых генотипа. Таким образом, семена из коллекции кургана № 2 показывали высокую степень гетерогенности при использовании PBS праймеров, характерную для неселекционных форм растений.

Вместе с тем результаты радиоуглеродного анализа показали, что семена были занесены в погребальную камеру в середине XX в. Тем не менее находка имеет важное значение в археологической науке, так как впервые в Казахстане семена из погребального памятника исследованы на молекулярно-генетическом уровне и успешно проращены в лабораторных условиях. Этот пример подчёркивает необходимость по возможности отбирать несколько различных образцов из одного кургана при проведении радиоуглеродного анализа. Такой подход позволяет более точно определить хронологические рамки памятника и избежать преждевременных выводов о ряде элементов погребальной обрядности в древнем обществе.

Таблица 1. Мог. Каратобе. Результаты радиоуглеродного анализа

№	Lab code	Monument	14C BP	Sample	Calibrating date (1σ)	Calibrating date (2σ)
1	FTMCRY88 -11	Karatobe Kurgan 2	2284±26	bone	68.3% probability 396 (57.2%) 361calBC 272 (6.2%) 265calBC 241 (4.8%) 236calBC	95.4% probability 401 (60.4%) 352 calBC 289 (33,6%) 227calBC 220 (1,5%) 210 calBC
2	FTMCRY88 -12	Karatobe Kurgan 2	-297±26	seeds	68.3% probability 1956 (68.3%) calAD	95.4 probability 1955 (1.2%) 1955calAD 1956 (74.5%) 1957calAD 2008 (6.6%) 2008calAD 2009 (13.1%) 2009calAD

Таблица 2. Всхожесть семян в зависимости от способа стерилизации

Вариант стерилизации	Количество семян	Количество инфицированных семян, шт.	Количество всхожих семян, шт.	Количество проростков, шт.
№1	5	100%	-	-
№2	10	-	1	1
№3	10	-	5	3

Таблица 3. Последовательности и характеристика используемых универсальных праймеров для генов 18S рибосомальной РНК и 23S

ID	Последовательность	Положение 18S-23S (KY860924); 18S rRNA (HG965134)	Tm (°C)	Информация
2943	GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG	1255 → 1276	51.3	ITS5
2944	TCCTCCGCTTATTGATATGC	1968 ← 1987	51.4	ITS4
2949	AACCTTATCATTTAGAGGAAGG	1239 → 1260	48.9	ITS1
3173	GGAGCCTGAGAAACGGCTACCAC	1004 → 1026	61.6	18S rRNA
3174	ATACGAATGCCCCCGACTGTCC	1483 ← 1504	60.4	(HG965134)

МАИАСП № 21. 2025

Археоботаническое и молекулярное исследование семян из кургана № 2 могильника Каратобе

Таблица 4. Последовательности и характеристика используемых 18-мерных PBS праймеров

ID	Последовательность (5’-3’)	T m ( ° C)	ГЦ-состав (%)
2222	ACTTGGATGCCGATACCA	51.9	50.0
2224	ATCCTGGCAATGGAACCA	52.3	50.0
2229	CGACCTGTTCTGATACCA	49.9	50.0
2230	TCTAGGCGTCTGATACCA	50.3	50.0
2232	AGAGAGGCTCGGATACCA	52.6	55.6
2238	ACCTAGCTCATGATGCCA	51.5	50.0
2239	ACCTAGGCTCGGATGCCA	56.2	61.1
2399	AAACTGGCAACGGCGCCA	59.7	61.1