Использование тест-системы GenoType® MTBDRsl в диагностике лекарственно устойчивого туберкулеза в Самарской области

Туберкулез (ТБ) остается одной из важнейших проблем здравоохранения во всем мире. По данным Всемирной организации здравоохранения, ежегодно в мире от ТБ погибает около 2 миллионов человек [1]. Считается, что около трети населения Земли являются носителями возбудителя ТБ — Mycobacterium tuberculosis.

Штаммы микобактерий с лекарственной устойчивостью вызывают наиболее тяжело протекающие формы ТБ, при этом лекарственно-устойчивый ТБ сложнее диагностируется и лечится, что обуславливает более высокую летальность по сравнению с лекарственночувствительным ТБ.

Российская Федерация считается страной с высокими уровнями заболеваемости и распространенности ТБ, в том числе, ТБ с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ ТБ), который вызывается микобактериями, устойчивыми к двум основным противотуберкулезным препаратам: «Изониазиду» и «Рифампицину» [2]. Самарская область является районом с неблагополучной обстановкой по заболеваемости ТБ: около 20 % всех впервые выявленных пациентов инфицированы штаммами МЛУ ТБ [3].

В последнее десятилетие в Российской Федерации значительно возросли уровни распространенности ТБ с обширной лекарственной устойчивостью (ОЛУ ТБ), когда микобактерии обладают устойчивостью не только к «Изониазиду» и «Рифампицину», но и к так называемым резервным препаратам: фторхинолонам (ФХ) и инъекционным препаратам [4, 5]. Лечение таких больных представляет особую проблему, а летальность, особенно у больных с со- четанной ВИЧ/ТБ инфекцией, может достигать 100 %.

В связи с возрастанием доли МЛУ и ОЛУ ТБ в структуре заболеваемости в РФ и, в частности в Самарской области, крайне необходимо развивать и внедрять новые ускоренные методы диагностики лекарственной устойчивости у полученных от пациента микобактерий. Своевременная диагностика лекарственной устойчивости позволяет вовремя назначить адекватную химиотерапию ТБ, что в свою очередь предотвращает распространение лекарственно-устойчивых микобактерий и заражение других людей.

Внедрение в рутинную лабораторную практику автоматизированных систем культивирования бактерий с использованием жидких питательных сред значительно сократило время выполнения тестов на лекарственную чувствительность, однако такие системы достаточно дороги и сложны в обращении, а для получения результата необходимо от 7 до 10 дней [6].

Другим подходом в определении лекарственной чувствительности штаммов микобактерий является детекция мутаций в генах, ассоциированных с устойчивостью к тем или иным противотуберкулезным препаратам. Известно, что устойчивость микобактерий к лекарственным препаратам из группы ФХ определяется мутациями в генах gyrA и gyrB, кодирующих соответственно субъединицы А и В ДНК-гиразы [7]. На детекции мутаций в этих генах, а также в генах, ассоциированных с устойчивостью к другим противотуберкулезным препаратам – «Этамбутолу», аминогликозидам и циклическим пептидам основана недавно разработанная компанией Hain Lifescience (Hain Lifescience, GmbH, Нерен, Германия) тест-система GenoType® MTBDRsl. Ранее высокие показатели чувствительности и специфичности указанной тест-системы были продемонстрированы в странах с низкими уровнями распространенности ТБ [8, 9].

Таким образом, целью нашего исследования было изучение чувствительности и специфичности тест-системы GenoType® MTBDRsl для выявления устойчивости к ФХ («Офлоксацину» и «Моксифлоксацину») на материале культур M .tuberculosis в регионе (Самарская область) с высокими уровнями заболеваемости ТБ и значительной распространенностью лекарственно-устойчивых форм ТБ.

Материалы и методы. Нами были исследованы изоляты (N=51) M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, полученные от больных ТБ в 2008 году. Количество впервые выявленных и получавших лечение в прошлом составило 23 и 28 случаев соответственно. Материалом для посева служила мокрота больных; культивирование микобактерий осуществлялось при помощи автоматизированной системы жидких питательных сред BACTEC 960 (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) по рекомендуемой производителем методике [10]. Фенотипические ТЛЧ к ФХ проводились в системе BACTEC 960 по рекомендуемой производителем методике с использованием следующих концентраций антибиотиков: «Офлоксацин» 2,0 мкг/мл, «Моксифлоксацин» 0,25 мкг/мл [11]. ДНК выделялась из полученной культуры микобактерий методом нагревания при 95⁰С с последующей обработкой ультразвуком в течение 15 минут.

Идентификация полученной культуры, а также молекулярно-генетическое определение чувствительности к противотуберкулезным препаратам производились с помощью тест-системы GenoType® MTBDRsl согласно рекомендациям производителя. Прочтение и интерпретация результатов проводились независимо двумя операторами, не знакомыми с результатами фенотипического ТЛЧ. Если исследуемый образец давал плохой результат на тест- системе GenoType® MTBDRsl, тест повторялся еще раз, и если результат не улучшался, он учитывался как нечитаемый.

Статистический анализ данных проводился с использованием критерия Фишера с уровнем значимости P=0,05.

Результаты и обсуждение. Фенотипически устойчивость к ФХ была определена у 32 из 51 исследуемого МЛУ ТБ штамма (62,7 %). Между результатами чувствительности к «Офлоксацину» и «Моксифлоксацину» было полное совпадение, что подтверждает хорошо известное явление перекрестной устойчивости к препаратам группы ФХ.

Из 51 протестированного с помощью системы GenoType® MTBDRsl штамма 48 дали читаемый результат, что составило 94,1 %. Устойчивость к ФХ по результатам молекулярногенетических тестов была выявлена у 25 из 32 фенотипически устойчивых штаммов. У 3 штаммов были определены смешанные генотипы: присутствовали и дикие, и мутантные аллели гена gyrA . Согласно рекомендациям производителя, такие штаммы были интерпретированы как устойчивые к ФХ. Четыре фенотипически устойчивых штамма не имели мутаций в гене gyrA , тогда как фенотипические результаты и результаты MTBDRsl для чувствительных штаммов полностью совпали.

В целом чувствительность и специфичность тест-системы GenoType® MTBDRsl по сравнению со стандартным методом ТЛЧ составила 86,2 и 100 % соответственно. Тем не менее, результаты молекулярно-генетического метода для трех фенотипически устойчивых штаммов (5,9 %) остались нечитаемыми даже после двух повторов.

Наши данные согласуются с предыдущими исследованиями, показывающими эффективность применения тест-системы GenoType® MTBDRsl в областях с высокими уровнями лекарственной устойчивости, особенно, первоначального скрининга пациентов и экспресс-диагностики случаев ОЛУ ТБ [12].

Одним из факторов, лимитирующих чувствительность тест-системы GenoType® MTBDRsl, является ограниченное количество ДНК-проб и генов, включенных в тест-систему. Так, 4 фенотипически устойчивых штамма, давшие чувствительный результат на системе GenoType® MTBDRsl, могут иметь мутации в других кодонах гена gyrA или в гене gyrB , не исследуемых тест-системой GenoType® MTBDRsl, что дало разногласие между фенотипическим и молекулярным результатами.

Таким образом, можно сделать вывод, что тест-система GenoType® MTBDRsl является достаточно точной и быстрой методикой определения устойчивости бактерий M. tuberculosis к ФХ со 100 % специфичностью (несмотря на то, что 5,9 % анализируемых штаммов не дали читаемого результата), однако для подтверждения ее результатов и исключения случаев ОЛУ ТБ по-прежнему необходимы основанные на культивации микобактерий бактериологические методы диагностики.