Исследование консорциума микроорганизмов при культивировании в низколактозных молочных смесях

Актуальным направлением развития пищевых биотехнологий на современном этапе является разработка технологий производства «продуктов с добавленной стоимостью», то есть продуктов с направленными свойствами ‒ регулируемым углеводным, жирнокислотным и аминокислотным составом. К таким пищевым продуктам можно отнести ферментированные пищевые продукты с пониженным содержанием лактозы, которые показаны людям с непереносимостью данного компонента молока.

Для ферментирования молочных смесей традиционно применяются молочнокислые микроорганизмы, свойства которых хорошо изучены и доказана их биологическая безопасность, тем не менее, представляет интерес изучение биохимических характеристик молочнокислых микроорганизмов при развитии их в смесях с направленно измененным составом основных нутриентов молока с целью регулирования технологии [1].

Технология получения низколактозных продуктов предполагает несколько способов. Наиболее известными считаются следующие:

получение сквашенных (кисломолочных) продуктов с использованием заквасочных культур молочнокислых бактерий; ферментативное расщепление лактозы, технология мембранной фильтрации [2]. В предлагаемой технологии осуществляется частичный ферментативный гидролиз лактозы с последующим культивированием в молочной основе микроорганизмов закваски, которые трансформируют оставшуюся лактозу.

Важными условиями для проявления жизнедеятельности микроорганизмов являются такие электрохимические характеристики среды как активная кислотность, степень окисления и восстановления среды и окислительно-восстановительный потенциал, которые влияют на рост и развитие микроорганизмов. Даже незначительные изменения рН заметно влияют на рост и развитие микроорганизмов, так как от величины рН зависят активность белка и его конформация. Данный параметр оказывает существенное влияние на процессы клеточного транспорта, скорости ферментативных реакций, а следовательно, и на скорость роста клеток. Молочнокислые бактерии растут в диапазоне рН 3,5–4,2 [1].

Микроорганизмы также могут менять эти характеристики в процессе метаболизма для создания наиболее оптимальных условий для своего развития. Известно, что в биологических системах, таких как кисломолочные продукты, основой для всех процессов, происходящих в клетке, служат окисление и восстановление. По изменению окислительно-восстановительного потенциала ферментированной среды можно судить об интенсивности развития микроорганизмов и направленности вызываемых ими биохимических процессов [1, 3].

Окислительно-восстановительный потенциал при культивировании микроорганизмов принято выражать через rH2, которые изменяются в диапазоне от 0 до 41 и характеризуют степень насыщения раствора водородом и кислородом, то есть степень аэробности среды.

Микроорганизмы в определенной степени способны изменять rH2 питательной среды, на которой они растут, доводя его до наиболее подходящего для их роста значения посредством выделения восстановителей. Окислительно-восстановительный потенциал имеет особенно важное значение при производстве продуктов с применением технологии брожения, к таким продуктам относятся ферментированные молочные продукты, технология производства которых основана на молочнокислом брожении лактозы заквасочной микрофлорой [4].

Микроорганизмы образуют в среде культивирования сложные биоценозы, при которых каждый микроорганизм находится в отношении стимулирования или угнетения со стороны других микроорганизмов. Поэтому актуальным является изучение консорциума микроорганизмов закваски при культивировании их в молочных средах с измененным составом – молочных смесях с повышенным содержанием сухих веществ молока и частично гидролизованной лактозой как основы для производства низколактозных кисломолочных напитков [5].

Цель исследования ‒ изучение динамики молочнокислого процесса при развитии консорциума молочнокислых микроорганизмов в молочных смесях с направленно измененным составом с целью разработки технологии кисломолочных напитков с пониженным содержанием лактозы для группы потребителей с непереносимостью лактозы молока.

Методика исследования

При проведении исследований применяли общепринятые методики определения титруемой и активной кислотности [6], окислительновосстановительного потенциала [7], давление молекулярного водорода [7].

Исследовали характер молочнокислого процесса в молочных смесях с массовой долей сухих обезжиренных веществ 12% и степенью гидролиза лактозы 66±1% [8]. При изучении метаболических процессов микроорганизмов в качестве заквасочных культур были выбраны болгарская палочка и термофильный стрептококк. Молочнокислые микроорганизмы характеризуются высокой β-галактозидазной активностью, так как основным источником углеводов для них является лактоза. Косвенным признаком β-галактозидазной активности молочнокислых бактерий является их кислотообразующая активность в молоке. Наибольшая активность β-галактозидазы обнаружена у болгарской палочки, которая превышает данный показатель термофильного стрептококка и бифидобактерий на 15 и 64% соответственно [1]. Фермент β-галактозидаза, синтезируемый болгарской палочкой и термофильным стрептококком может продуцироваться микроорганизмами независимо от того, в каких условиях находится клетка [3]. Поэтому при выборе состава микроорганизмов закваски для низколактозного продукта были выбраны именно эти лактобактерии.

Величина активности β-галактозидазы данных микроорганизмов согласуется с количеством бактериальных культур [1, 5]. В связи с этим исследовали различные соотношения термофильного стрептококка (Т) и болгарской палочки (Б). При подборе были рассмотрены следующие варианты: 1Б:4Т ‒ 1% ‒ (Б), 4% ‒ (Т); 2Б:4Т; 3Б:4Т. Выбрана оптимальная температура ферментации для данного консорциума микроорганизмов ‒ 40±2°С, продолжительность 4 ч.

Для оценки активности процессов обмена веществ у микроорганизмов в ферментированных образцах определяли в динамике окислительно-восстановительный потенциал (Еh), активную (рН) и титруемую кислотности (К). Рассчитывали показатель rH2 ‒ давление молекулярного водорода, характеризующий окислительно-восстановительные условия среды [7, 9].

rH2 = Еh/0,03 + 2рН

Исходная смесь до внесения закваски имела следующие показатели: рН = 6,3±0,1; Еh = 250±10мВ; rH₂ = 20,9; титруемую кислотность 25±1ºT. Результаты исследования представлены в таблице.

Таблица 1 — Динамика молочнокислого процесса

Экспо ч зиция,      рН        Еh, мВ       rH2        К, ºT при соотношении болгарской палочки к термофильному стрептококку 1:4
0	6,3±0,1	+220±10	19,9	31±1
1	6,3±0,1	+200±10	19,3	34±1
2	5,9±0,1	+140±10	16,5	61±1
2,5	5,7±0,1	+135±10	15,9	62±1
3	5,3±0,1	+57±10	12,5	70±1
3,5	4,9±0,1	-72±10	7,4	71±1
4	4,7±0,1	-90±10	6,4	72±1
при соотношении болгарской палочки к термофильному стрептококку 2:4
0	6,3±0,1	+220±10	19,9	32±1
1	6,3±0,1	+200±10	19,3	33±1
2	6,0±0,1	+140±10	16,7	61±1
2,5	5,8±0,1	+130±10	15,9	62±1
3	4,7±0,1	+60±10	11,4	69±1
3,5	4,6±0,1	-102±10	6,1	75±1
4	4,5±0,1	-195±10	2,5	79±1
при соотношении болгарской палочки к термофильному стрептококку 3:4
0	6,3±0,1	+220±10	19,9	34±1
1	6,3±0,1	+200±10	19,3	36±1
2	5,9±0,1	+142±10	16,5	61±1
2,5	5,3±0,1	+50±10	9,1	70±1
3	4,7±0,1	-190±10	3,07	78±1
3,5	4,4±0,1	-202±10	2,1	83±1
4	4,3±0,1	-217±10	1,37	90±1

Приведенные в таблице исходные значения Eh оказались меньше, чем в смеси без внесения закваски (соответственно 220±10 и 250±10мв), что, по-видимому, вызвано введением в среду дополнительных компонентов, влияющих на Eh, с закваской: это аскорбиновая кислота, цистеин, рибофлавин, коферменты дегидрогеназ и оксидаз и другие.

Равенство рН в молочной смеси до и сразу же после внесения закваски связано с большой буферной емкостью системы при любом соотношении термофильного стрептококка и болгарской палочки в течение 1 ч значения рН, благодаря наличию индукционного периода и высокой буферной емкости смеси, оставались неизменными. Далее эти показатели неуклонно снижались и практически не зависели от соотношения микроорганизмов в составе закваски, что также связано с большой буферной емкостью смеси.

Динамика Eh модельных образцов в процессе сквашивания приведена на рисунке. Известно, что Eh является показателем свободной энергии системы: чем ниже его значение, тем больше запас свободной энергии, система менее устойчива, и в ней легче самопроизвольно протекают различные физико-химические процессы, например, застудневание белков, синерезис и другие [5, 6, 9]. В связи с этим, менее устойчивым к синерезису является образец, при производстве которого используется закваска с соотношением болгарской палочки к термофильному стрептококку, равным 3:4.

Более полной характеристикой окислительно-восстановительных свойств молока является показатель rH2 – «давление молекулярного водорода», дающий более объективную характеристику его окислительно-восстановительных свойств.

□ 1Б4Т И2Б4Т ПЗБ4Т

Рисунок 1 — Динамика Eh модельных образцов в процессе сквашивания

Так, А. Тепел указывает, что в абсолютно электронейтральной среде при равновесии окислительных и восстановительных процессов rH2=28; если rH2 выше 28, то среда обладает окислительной способностью и устойчивостью; ниже 28 – восстановительной способностью и большей или меньшей неустойчивостью [7].

Значение rH2 =20,9 для исходной смеси свидетельствует об агрегативной ее неустойчивости и необходимости применения стабилизаторов [7, 10].

Окислительно-восстановительные условия среды по показателю rH2 соответствуют оптимуму развития как молочнокислых палочек (0‒20), так и молочнокислых стрептококков (0‒30) [7]. Известно, что молочнокислые стрептококки при rH2 близком к нулю, образуют, в основном, молочную кислоту, а при rH,2 более 6‒8, наряду с молочной кислотой – и ароматические вещества [7, 11, 12]. Таким образом, окислительно-восстановительные условия протекания процесса ферментации исследуемыми видами микроорганизмов благоприятны для образования основных вкусовых и ароматических веществ в низколактозном йогурте.

Исследование динамики титруемой кислотности показало, что при увеличении концентрации болгарской палочки в сочетании с термофильным стрептококком снижалось содержание лактозы в продукте, что говорит об увеличении β-галактозидазной активности изученной комбинации культур.

Наибольшую β-галактозидазную активность проявлял консорциум микроорганизмов ‒ болгарская палочка в сочетании с термофильном стрептококком в соотношении 3:4. Контрольный показатель (80°Т) достигался уже через 3 ч сквашивания, в то время как в других случаях наблюдали замедленный рост этого параметра, пропорциональный увеличению доли термофильного стрептококка в составе закваски, что естественно, поскольку термофильный стрептококк является менее активным кислотообразователем, чем болгарская палочка [3, 13].

Несмотря на то, что по показателю Eh образцы, в которых использовалась закваска с соотношением болгарской палочки к термофильному стрептококку 3:4, обладали меньшей устойчивостью к синерезису, в дальнейших исследованиях использовали именно это соотношение, поскольку необходимый уровень титруемой кислотности 75…85°Т и рН 4,6…4,37 [8, 14] достигался уже через 3 ч сквашивания.

Для получения низколактозного йогурта возможно применение заквасок и с соотношением болгарской палочки к термофильному стрептококку 2:4. В этом случае необходимые уровни титруемой и активной кислотности достигались через 3,5…4 ч ферментации.

Использование заквасок с соотношением болгарской палочки к рмофильному стрептококку 1: нецелесообра ления                       са в ср

зно _Х из-за _С суще ствен-

еде,

тозу, гидролизованную примерно на 70%. Возможно, что торможение развития микроорганизмов закваски в молочной смеси, содержащей гидролизованную лактозу, по сравнению со смесями, применяемыми при производстве йогуртов, связано с двумя основными факторами. Во-первых, в результате гидролиза лактозы повышается осмотическое давление среды. Во-вторых, в среде увеличивается количество гидрофильных частиц и, как следствие, понижается активность воды [12, 15]. Таким образом, молочная смесь с повышенной массовой долей сухих веществ, содержащая гидролизованную лактозу, обладает консервирующим действием по отношению к микроорганизмам закваски, и их развитие замедляется.