Историческая генетика Фанагории: геномный анализ людей из эллинистического склепа

1 Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 24-1420019, (Е.В.Р., А.Д.М., А.Н.В., Н.Г.С., Э.Д.А., С.С.К., С.Н.О., В.Д.К.).

Фанагория имеет продолжительную историю, ее основание в VI в. до н. э. связывают с появлением здесь греческих переселенцев с территории Малой Азии ( Кузнецов , 2019). Одним из актуальных вопросов является проблема формирования населения этого столичного города. Греческие переселенцы прибыли не на пустующую территорию. Их окружали многочисленные местные «варварские» племена (скифы, меоты, сарматы, синды и др.). Предполагается, что первые группы переселенцев были весьма немногочисленны, на что указывает демографическая ситуация первого столетия существования апойкии (численность населения ~ 1000 человек) ( Завойкин , 2013). Это обстоятельство, вероятно, послужило почвой для тесного взаимодействия между ионийскими переселенцами, их потомками и местными племенами, что, несомненно, отразилось на составе населения города. Согласно многочисленным археологическим и антропологическим свидетельствам, дальнейшее существование Фанагории было неразрывно связано с варварским окружением.

Современные методики палеогеномных исследований крупных антропологических коллекций в сочетании с биоархеологическими исследованиями представляют собой мощный инструмент, позволяющий эффективно изучать прошлое человечества и проверять конкретные исторические гипотезы. Антропологическая коллекция Фанагории на данный момент состоит из представительных материалов некрополя и немногочисленных находок в культурном слое города. Хронология коллекции весьма широка и охватывает временные рамки с IV в. до н. э. по IX в. н. э. Превалирующими являются антропологические материалы из Восточного некрополя, коллекция которых была детально охарактеризована с морфологической, палеодемографической и палеоэкологической точек зрения ( Добровольская, Свиркина , 2018; Свиркина , 2022).

Объектом данного исследования стали костные останки двух индивидов из эллинистического склепа № 247, обнаруженного Фанагорийской экспедицией ИА РАН при раскопках в 2015 г. Архитектура гробницы типична для грунтовых склепов позднеэллинистической Фанагории: дромос в виде прямоугольной шахты, коридор за каменным закладом, ведущий в небольшую погребальную камеру. По левую руку от входа, на полу камеры были обнаружены захоронения двух взрослых людей, лежавших вытянуто на спине рука об руку головами от дромоса. Мужчина был занесен в склеп первым, его уложили вдоль стены камеры. Рядом была похоронена его спутница. Необходимо отметить, что захоронения занимают около половины площади пола камеры, т. е. места для менее тесного расположения умерших было достаточно. Между тем женщину уложили таким образом, что она оказалась плотно прижата к мужчине. Это обстоятельство, скорее всего, свидетельствует о преднамеренном замысле в расположении тел погребенной пары. Правая рука женщины лежала поверх левой руки мужчины, вероятно, маркируя такой погребальной позой близость этих людей при жизни. Единый для двух захоронений в склепе набор погребального инвентаря группировался в оставшейся свободной половине камеры – в ее восточном углу. Обнаруженный погребальный инвентарь весьма типичен для эллинистических склепов Азиатского Боспора, он представлен большим количеством посуды: красноглиняные лекана с крышкой, пелика, кувшин и чернолаковое рыбное блюдо. Керамический комплекс позволяет датировать склеп II в. до н. э. Не противоречит этой датировке и монета у черепа мужчины. Она принадлежит к массовому боспорскому типу монет фанагорийского некрополя – фанагорийский «сатир/лук и стрела» – и датируется 200–110 гг. до н. э. (Абрамзон и др., 2022).

Выбор именно этого погребения для палеогеномных исследований неслучаен. Согласно ранее проведенным исследованиям, мужчина и женщина характеризуются различными стратегиями питания, предполагается, что это может быть связано с их разным происхождением ( Свиркина , 2019; 2022). Между тем подчеркнем, что археологический контекст захоронения мужчины и женщины в полной мере соответствует погребальной традиции позднеэллинистического Боспора и, в частности, Фанагории. Погребение пары в одном небольшом склепе – семейной усыпальнице с набором многочисленной керамической посуды характерно для жителей города, принадлежавших к достаточно обеспеченным слоям его населения. Таким образом, зафиксированный погребальный обряд не содержит «археологических» аргументов «инородности» захороненных в склепе людей. Более того, он свидетельствует о приверженности этой пары и их родственников эллинским погребальным традициям, распространенным на территории Боспорского царства в эллинистическое время.

Целью работы является соотнесение культурного единства, отраженного в погребальном обряде, параметров обыденной жизни (питание, индивидуальная мобильность) и генетических профилей индивидов, совместно погребенных в грунтовом склепе.

Материалы и методы

Палеоантропологические материалы, использованные в исследовании, хранятся в научно-исследовательском центре «Фанагория» (Краснодарский край, пос. Сенной).

Антропологическое описание индивидов из склепа 247/2015. Оба индивида (женщина и мужчина) старше 50 лет. Сохранность скелетов не позволила выполнить кранио- и остеометрические исследования в полном объеме. Из выявленных патологий отметим прижизненную утрату моляров нижней челюсти, кариес на премоляре у женщины и прижизненную утрату большинства жевательных зубов на нижней челюсти слева – у мужчины. Образцы костей и эмали зубов этих индивидов ранее были включены в изотопные исследования в рамках масштабного проекта по изучению питания и мобильности населения Фанагории эллинистического, римского и позднеантичного периодов. Выбранные для генетического исследования индивиды характеризуются различными стратегиями питания. Мужчина (образец Fan24) принадлежит к основной, наиболее многочисленной для Фанагории группе горожан, в рационе питания которой, по всей видимости, большую роль играла белковая составляющая, основанная на растениях C3-типа фотосинтеза. В то время как женщина (образец Fan23) относится к небольшой группе жителей столицы Азиатского Боспора с более высокими значениями δ13C, что может быть связано либо с употреблением растений C4-типа фотосинтеза (вероятно, проса), либо с включением в рацион белковой пищи, добытой из моря или пресноводных водоемов. Предположительно женщина могла быть мигрантом или потомком переселенцев. Однако анализ соотношения изотопов стронция (87Sr/86Sr) эмали зубов мужчины и женщины не показал различий между ними. Это означает, что детство этих индивидов проходило на территории со схожим геохимическим сигналом. Важно уточнить, что их изотопные показатели схожи с показателями других индивидов из некрополя Фанагории и не выходят за пределы значений, характерных для микрорегиона (Свиркина, 2021; 2022).

Получение препаратов древней ДНК (дДНК) из костных фрагментов весом 40–120 мг проводили на базе университета «Сириус» в специальных помещениях, предназначенных для работы с древней ДНК, согласно разработанной ранее методике ( Andreeva et al. , 2022). Каждый эксперимент по выделению ДНК сопровождался отрицательным контролем. Качественную и количественную оценки полученных препаратов ДНК проводили методом капиллярного гель-электро-фореза на приборе Agilent TapeStation 4150 с использование набора реагентов High Sensitivity D1000 (Agilent). Фрагментные геномные библиотеки готовили по протоколу, основанному на использовании одноцепочечной ДНК ( Gansauge et al. , 2017). Для образца Fan24 дополнительно приготовили фрагментную библиотеку из препарата дДНК, подвергнутого репарации с использованием набора реагентов PreCR Repair Mix (NEB) ( Mouttham et al. , 2015). Секвенирование проведено на базе университета «Сириус» на платформе Illumina MiSeq в режиме парно-концевых прочтений длиной 76 + 76 нуклеотидов (тестовое секвенирование) и Illumina NovaSeq 6000 в режиме одноконцевых прочтений длиной 56 нуклеотидов (глубокое секвенирование).

С помощью программы AdapterRemoval v2 ( Schubert et al. , 2016) из полученных результатов секвенирования удалялись адаптерные последовательности и последовательности с низким качеством. Затем с помощью программы BWA ( Li, Durbin , 2009) с параметрами, адаптированными для данных секвенирования дДНК ( Schubert et al. , 2012), проводилось картирование полученных прочтений относительно референсного (GRCh37) и митохондриального (мтДНК, NC_012920.1) геномов человека. С помощью функции MarkDuplicates из пакета программ Picard (Picard toolkit, 2019) маркировали и удаляли из дальнейшего анализа прочтения дубликаты.

Оценку аутентичности древней ДНК проводили с помощью программы MapDamage2 ( Jónsson et al. , 2013), а определение генетического пола исследуемых образцов – с помощью программы karyo_RxRy ( Anastasiadou et al. , 2024).

Оценка уровня контаминации образцов проводилась по гетерозиготности мтДНК с помощью программ Schmutzi ( Renaud et al. , 2015) и ContamMix ( Fu et al. , 2013). Для образца Fan24 (мужчина) дополнительно проведен анализ уровня контаминации по гетерозиготности X-хромосомы ( Rasmussen et al. , 2011).

Определение гаплогрупп мтДНК проводили с использованием программы Haplogrep3 (версия PhyloTree 17 – Forensic Update 1.2) ( Schönherr et al. , 2023)

с дополнительной проверкой обнаруженных вариантов по базе данных Yfull (MTree) (YFull, 2024). Для филогеографического анализа мтДНК сформировали выборку последовательностей мтДНК, принадлежащих к гаплогруппе, выявленной у исследуемого индивида, для чего использовали базы, содержащие древние образцы AmtDB ( Ehler et al. , 2019), HaploTree (HaploTree, 2025), AADR ( Mallick et al. , 2024). Последовательности мтДНК современных образцов известного географического и/или этнического происхождения отбирали из базы NCBI с помощью программы BLAST с использованием следующих фильтров: покрытие целевой последовательности (Query Cover = 100 %), идентичность (Per. identity > 99,98 для образца Fan23 и Per. identity > 99,95 для образца Fan24). Кроме того, использовались базы данных древних образцов, ранее составленных в НТУ «Сириус» ( Андреева и др. , 2022). Филогенетические деревья строили с помощью программы mtPhyl ( Eltsov, Volodko , 2016).

Определение гаплогруппы Y-хромосомы для образца Fan24 проводили с помощью программы Yhaplo ( Poznik , 2016) на основе генетических вариантов, обнаруженных программой FreeBayes ( Garrison, Marth , 2012). Для уточнения Y-хромосомной линии дополнительно проверяли ее маркеры, а также маркеры дочерних гаплогрупп, представленных в базах данных ISOGG (International Society…, 2024) и Yfull (ytree) (Yfull, 2024) путем визуального анализа результатов картирования данных секвенирования в программе IGV ( Robinson et al. , 2011).

С помощью программы pileupCaller из SequenceTools-пакета (SequenceTools, 2025) были реконструированы псевдогаплоидные (опция «--randomHaploid») геномные профили исследуемых индивидов по 1240 тыс. генетических маркеров, соответствующие панели AADR (version v62.0). При этом для анализа использовали прочтения с качеством выравнивания (MQ) и качеством прочтения (BQ) не менее 30.

Установление генетического родства проводилось с помощью программы READv2 ( Alaçamlı et al. , 2024), позволяющей определять родство вплоть до третьей степени. Анализ проводили, используя как полные псевдогаплоидные (по 1240 тыс. генетических маркеров) геномные профили исследуемых индивидов, так и профили без транзиций (C ↔ T и G ↔ A), которые могут быть следствием постмортальных модификаций, характерных для древней ДНК.

Популяционный анализ проводили с использованием метода главных компонент (PCA). При помощи функции smartpca из пакета программ EIGENSOFT (Patterson et al., 2006) геномные профили исследуемых индивидов проецировали в пространство главных компонент, сформированное на основе генетических профилей 1348 представителей 82 современных европейских (в том числе и из Средиземноморского региона) и кавказских популяций из панели Human Origin (Lazaridis et al., 2016), включающей в себя 600 тыс. генетических маркеров. Для оценки генетического сходства с древними популяциями, представленными в базе данных AADR (version v62.0), выполняли расчет f4-статистики. В анализ были включены псеводгаплоидные генотипы по панели из 1240 тыс. генетических маркеров. Расчеты f4-статистики проводили с использованием программ AdmixTools v.7.0.1 (Patterson et al., 2012) и Admixr v.0.9.1 (Petr et al., 2019). Расчет f4-статистики проводили в форме f4 (Mbuti, Test; Fan23, Fan24), где Test – одна из тестируемых предковых по- пуляций, представители африканской группы Мбути (Mbuti), использованные в качестве внешней группы. В анализ были включены только группы, представленные более чем тремя неродственными индивидами и имевшие не менее 20 тыс. генетических маркеров, пересекающихся с исследованными образцами Fan23 и Fan24.

Результаты

Из образцов костного материала (рис. 1, табл. 1) двух индивидов из склепа II в. до н. э. были успешно получены препараты геномной ДНК, которые были использованы для приготовления фрагментных геномных библиотек и их секвенирования. Результаты биоинформатической обработки полученных данных секвенирования подтвердили аутентичность дДНК обоих образцов (рис. 2). Высокая доля прочтений (табл. 1), картированных относительно референсного генома человека, свидетельствует о хорошей сохранности костного материала и пригодности полученных из него препаратов дДНК для полногеномного исследования.

Таблица 1. Данные: антропологические об исследованных образцах из склепа 247/2015 Фанагории и статистические по результатам их геномного секвенирования и оценки уровня контаминации