Элементы лабораторного регламента производства микробиопрепаратов в препаративной форме "смачивающийся порошок" на основе грибов-антагонистов из рода Trichoderma при поверхностном культивировании на жидких питательных средах

Введение. В лаборатории биометода ФГБНУ ВНИИМК многие годы ведутся исследования по разработке микробиологических средств защиты масличных и других сельскохозяйственных культур от болезней. Создана уникальная коллекция штаммов грибов и бактерий-продуцентов микробиопрепаратов – биофунгицидов. Разрабатываются технологии производства разных препаративных форм микробиопрепаратов и технологии их применения [1].

Ранее в лаборатории биометода были разработаны препаративные формы микробиопрепаратов: жидкая культура, паста и порошок на основе твёрдых носителей – питательных сред (семянки, лузга, отходы от очистки семян подсолнечника) и перлита. Но жидкие культуры и пасты, особенно на основе грибных штаммов-продуцентов, выдерживали хранение не более 10 суток и 3-х месяцев соответственно, даже в холодильнике, а порошки плохо смачивались в воде и забивали отверстия распылителей [2].

Поэтому в последние годы нами решается задача по увеличению срока хранения биопрепаратов без снижения титра в препаративной форме «смачивающийся порошок» (СП) при поверхностном вы- ращивании штаммов-продуцентов на жидкой питательной среде и конвекционной сушке током воздуха. Ранее нами проведены исследования по отработке элементов лабораторного регламента производства микробиопрепаратов в препаративной форме СП при поверхностном культивировании на жидких питательных средах перспективных грибных штаммов-продуцентов из рода Penicillium и бактерий из рода Bacillus [3; 4].

В данной работе приведены результаты исследований по разработке элементов лабораторного регламента производства микробиопрепарата в препаративной форме СП при поверхностном культивировании перспективного грибного штамма-продуцента Т-2 Trichoderma sp . из коллекции лаборатории биометода на жидкой питательной среде. Решены задачи:

• -    по установлению оптимальных сроков поверхностного культивирования штамма-продуцента на жидких питательных средах и объёма посевной суспензии для максимального образования биомассы;

• -    по определению сроков хранения опытных образцов микробиопрепаратов в препаративной форме СП на основе штамма-продуцента в зависимости от упаковки, температуры и стабилизаторов без значительного снижения титра.

Материалы и методы. Для установления оптимальных сроков поверхностного культивирования штамм-продуцент выращивали на жидкой питательной среде Рудакова [5] в течение 10, 15 и 20 суток. Определяли массу порошка и титр. Для определения оптимального объёма посевной культуры к 500 мл питательной среды добавляли 2 и 4 % глубинной культуры антагониста, которую предварительно выращивали на жидкой среде, на качалке (195 об./мин) в течение трех суток. Сроки хранения опытных образцов в препаративной форме СП определяли в зависимости от упаковки, температуры и стабилизаторов. Штамм-продуцент выращивали поверхностным способом на жидкой питательной среде при оптимальной температуре 25 °С. Выращенную мицели- альную плёнку гриба отделяли сливом культуральной жидкости. Затем к биомассе добавляли прилипатель (3 %), рас-текатель (0,5 %) и наполнитель (20 %). Всё перемешивали, высушивали под вытяжкой при температуре 25–28 °С и размалывали на мельнице с охлаждением. Определяли влажность сырой биомассы и СП методом высушивания до постоянного веса [6]. Опытные образцы хранили в банках с плотно закрытой крышкой объемом 100 мл и бумажных пакетах с доступом воздуха (при этом обе упаковки заполняли СП на 30 % от объема) при постоянных (+30 и -18 °С) и переменной (+24^+26 °С) температурах. При переменной температуре испытывали стабилизаторы: резорцин (0,1 %), тиомоче -вину (0,05 %), аскорбиновую кислоту (0,05 %), бензоат натрия (0,1 %), сульфат меди (0,05 %), гумат натрия (0,5 %), мелассу (0,3 %), уголь активированный (0,5 %), двуокись титана (1,0 %) и гентамицин (0,015 %). Через 3, 6, 9 и 12 месяцев хранения микробиопрепарата определяли титр микробиологическим способом [7].

Результаты и обсуждение . Опытные образцы микробиопрепарата в препаративной форме СП, полученные при поверхностном культивировании штамма Т-2 Trichoderma sp . на жидкой питательной среде Рудакова, образовывали в воде стойкую суспензию, имели исходный титр 10^9-10 КОЕ/г.

Установлен оптимальный срок поверхностного культивирования грибного штамма-продуцента микробиопрепарата Т-2 Trichoderma sp. на жидкой питательной среде (табл. 1).

Установлено, что при всех сроках поверхностного культивирования грибного штамма-продуцента на жидкой питательной среде, из опытных образцов сырой биомассы, получена примерно одинаковая масса СП, с влажностью 5,4–6,5 %. С увеличением срока поверхностного культивирования гриба с 10 до 15 и 20 суток вес СП увеличивался незначительно и составил соответственно 10,06; 12,18 и 12,87 г на 500 мл питательной среды.

Таблица 1

Влияние срока поверхностного культивирования и объёма посевной суспензии грибного штамма-продуцента Т-2 Trichoderma sp. на массу опытного образца микробиопрепарата в препаративной форме «смачивающийся порошок» и титр г. Краснодар, ВНИИМК, 2017 г.

Ва ри-ант	Объ ём посев-ной сус-пен-зии, %	Срок культивирования, сутки
		10		15		20
		Масса СП, г	Титр, КОЕ/г	Масса СП, г	Титр, КОЕ/г	Масса СП, г	Титр, КОЕ/г
Т-2	2,0	10,06 ± 0,08	1,8 х 1010	12,18 ± 0,03	4,5 х 1010	12,79 ± 0,03	6,5 х 1010
	4,0	10,3 ± 0,03	2,9 х 1010	11,51 ± 0,07	4,9 х 1010	12,87 ± 0,05	7,9 х 1010

Примечание: *СП - микробиопрепарат в препаративной форме «смачивающийся порошок»

Увеличение объёма посевной культуры к питательной среде с 2 до 4 % значительно не повышало выхода СП, который составил 10,06 и 10,30 г; 12,18 и 11,51 г; 12,79 и 12,87 г соответственно через 10, 15 и 20 суток культивирования. Титр опытных образцов СП микробиопрепарата не зависел от сроков культивирования штамма-продуцента и был одного порядка во всех вариантах выращивания (1,8– 7,9 х 1010 КОЕ/г).

Таким образом, оптимальный срок поверхностного культивирования грибного штамма Т-2 Trichoderma sp. на жидкой питательной среде Рудакова составил 10 суток, а оптимальный объём посевной культуры - 2 %.

Установлены сроки хранения опытных образцов микробиопрепарата на основе грибного штамма-продуцента микробиопрепарата Т-2 Trichoderma sp . в препаративной форме СП в зависимости от герметичности упаковки и температуры хранения (табл. 2).

Изначальный титр опытного образца СП микробиопрепарата был 6,4 х 109 КОЕ/г. При хранении СП микробиопрепарата в пакетах с доступом воздуха и банках с плотно закрытой крышкой при постоянной низкой температуре (-18 °С) в тече- ние двенадцати месяцев титр сохранялся одного порядка с первоначальным уровнем (3,2–3,9 × 109 КОЕ/г). При переменной температуре (+24…+26 °С) через шесть месяцев титр СП снизился на один порядок как в банке, так и в пакете и сохранялся таким двенадцать месяцев (1,2– 6,0 × 108 КОЕ).

Таблица 2

Влияние температуры и упаковки на титр опытных образцов микробиопрепарата в препаративной форме «смачивающийся порошок» на основе грибного штамма-продуцента Т-2 Trichoderma sp. в процессе хранения г. Краснодар, ВНИИМК, 2017 г.

Срок хранения, месяцев	Титр, КОЕ/г
	+24… +26 °С		+30 °С		- 18 °С
	пакет	банка	пакет	банка	пакет	банка
3	1,5 × 109	1,2 × 109	3,7 × 107	3,3 × 107	5,7 × 109	6,4 × 109
6	3,1 × 108	6,0 × 108	5,0 × 106	4,2 × 106	2,5 × 109	4,7 × 109
9	2,2 × 108	2,8 × 108	2,6 × 105	3,2 × 105	3,1 × 109	4,0 × 109
12	1,2 × 108	1,6 × 108	1,0 × 105	1,2 × 105	3,2 × 109	3,9 × 109

При постоянной высокой температуре (+30 °С) титр СП микробиопрепарата на основе гриба-антагониста в течение двенадцати месяцев снизился до 105 КОЕ/г.

Таким образом, при хранении опытного образца микробиопрепарата на основе грибного штамма Т-2 Trichoderma sp . в препаративной форме «смачивающийся порошок» в пакетах с доступом воздуха и банках с плотно закрытой крышкой в условиях постоянно низкой температуры (-18 °С) титр в течение двенадцати месяцев не снизился. При переменной температуре в лаборатории (+24…+26 °С) за двенадцать месяцев хранения СП титр снизился на один порядок как в банке, так и в пакете (10⁸ КОЕ/г). При постоянно высокой температуре (+30 °С) за двенадцать месяцев хранения титр СП снизился на четыре порядка (10⁵ КОЕ/г).

Для установления влияния стабилизаторов на сроки хранения опытных образцов микробиопрепарата на основе грибного штамма-продуцента СП хранили в бумажных пакетах с доступом воз- духа при переменной температуре в помещении лаборатории от +24 до +26 оС (табл. 3).

Таблица 3

Влияние стабилизаторов на титр опытных образцов микробиопрепарата на основе грибного штамма-продуцента Т-2 Trichoderma sp. в препаративной форме СП при хранении в условиях переменной температуры г. Краснодар, ВНИИМК, 2017 г.

Вариант	Титр, КОЕ/г, через, месяцев
	3	6	9	12
Контроль	3,5 × 108	3,1 × 108	2,2 × 108	1,0 × 108
Резорцин 0,1	3,1 × 108	4,5 × 107	3,5 × 107	1,5 × 107
Тиомочевина 0,05	3,5 × 108	1,0 × 107	6,7 × 106	2,7 × 106
Аскорбиновая кислота 0,05	4,2 × 108	1,0 × 108	5,8 × 107	2,9 × 107
Бензоат натрия 0,1	3,3 × 108	2,0 × 107	4,6 × 106	2,6 × 106
Сульфат меди 0,005	4,5 × 108	4,0 × 108	2,9 × 108	1,8 × 108
Гидрохинон 0,1	5,3 × 108	3,0 × 108	2,8 × 108	1,0 × 108
Гумат натрия 0,5	5,5 × 108	1,0 × 108	4,5 × 107	2,5 × 107
Меласса 0,3	3,7 × 108	2,5 × 107	1,8 × 107	1,5 × 107
Двуокись титана 1,0	4,3 × 108	1,5 × 108	3,2 × 107	3,0 × 107
Уголь активированный 0,5	4,6 × 108	3,0108	4,7 × 107	3,5 × 107
Гентамицин 0,015	4,3 × 108	5,5 × 107	2,5 × 107	1,9 × 107

Исходный титр опытного образца СП микробиопрепарата на основе грибного штамма-продуцента Т-2 Trichoderma sp . в контроле без добавок составил 5,0 × 10⁹ КОЕ/г. При хранении в бумажном пакете в условиях переменной температуры от +24 до +26 °С в течение двенадцати месяцев титр микробиопрепарата снизился незначительно, на один порядок – с 10⁹ до 10⁸ КОЕ/г.

Добавление стабилизаторов не способствовало сохранению титра СП грибного препарата, а наоборот, снижало титр на порядок, а в вариантах с бензоатом натрия и тиомочевиной – на два порядка (106 КОЕ/г). Исключение составили варианты с сульфатом меди и гидрохиноном, в которых титр сохранился на уровне контроля.

Таким образом, установлено, что для сохранения опытных образцов микробиопрепарата на основе гриба Т-2 Trichoderma sp . с незначительным снижением титра (с 10⁹ до 10⁸ КОЕ/г) в течение двенадцати месяцев при переменной тем-85

пературе добавление стабилизаторов нецелесообразно.

Выводы. 1. Опытные образцы микробиопрепарата в препаративной форме СП, полученные при поверхностном культивировании штамма Т-2 Trichoderma sp . на жидкой питательной среде Рудакова, образовывали в воде стойкую суспензию, имели исходный титр 10^9–10 КОЕ/г и влажность 5,4–6,5 %.

• 2.    Оптимальный срок поверхностного культивирования грибного штамма Т-2 Trichoderma sp. на жидкой питательной среде Рудакова составил 10 суток, а оптимальный объём посевной культуры – 2 %.

• 3.    При хранении опытного образца СП микробиопрепарата в пакетах с доступом воздуха и банках с плотно закрытой крышкой при постоянной низкой температуре (-18 °С) в течение двенадцати месяцев титр сохранялся одного порядка с первоначальным уровнем (3,2–3,9 × 10⁹ КОЕ/г).

• 4.    При переменной температуре (+24…+26 °С) через шесть месяцев титр опытного образца СП микробиопрепарата снизился на один порядок как в банке, так и в пакете и сохранялся таким двенадцать месяцев (1,2–6,0 × 10⁸ КОЕ/г).

• 5.    При постоянной высокой температуре (+30 °С) титр опытного образца СП микробиопрепарата на основе гриба-антагониста в течение двенадцати месяцев снизился на четыре порядка – до 10⁵ КОЕ/г.

• 6.    Для сохранения опытных образцов СП микробиопрепарата на основе гриба Т-2 Trichoderma sp . с незначительным снижением титра (с 10⁹ до 10⁸ КОЕ/г) в течение двенадцати месяцев при переменной температуре добавление стабилизаторов нецелесообразно.

Исследования выполнены при финансовой поддержке РФФИ и администрации Краснодарского края, грант № 16-48-230293.