Миксоспоридии рода Myxobolus spp. (Cnidaria: Myxozoa) у плотвы Rutilus rutilus в озере Байкал: возрастная и сезонная зараженность и гистологическая характеристика

Миксоспоридии — одни из самых разнообразных видов паразитов рыб, их количество составляет около 2 425 [Zhang, 2013]. Среди них особое место занимает род Myxobolus Butschli, 1882, насчитывающий около 1 200 видов — паразиты пресноводных рыб [Eiras et al., 2005; Eiras et al., 2014). Наиболее часто миксоспоридии рода Myxobolus отмечаются у карповых рыб [Донец, Шульман, 1984, Landsberg and Lom, 1991; Lom and Dyková, 1992; Longshaw et al., 2003; Liu et al., 2019]. На основе только морфологии спор у плотвы на территории СССР в середине прошлого века было выявлено 20 видов миксоспоридий [Определитель, 1984]. Позже Ж. Эйраш и др. [Eiras 2005; 2014] в своих синопсисах рода Myxobolus приводят только 13 видов, описанных у плотвы как типового хозяина. Из них только у восьми видов имеются молекулярные данные [Molnár et al., 2014]. Комплексные исследования видового разнообразия миксоспоридий карповых рыб на территории России не проводились.

Цель работы: изучение фауны миксоспоридий рода Myxobolus от плотвы из оз. Байкал, описание возрастных и сезонных особенностей зараженности рыб, анализ данных последовательностей по 18S рДНК, а также представление дополнительных данных по морфологии спор, характеру паразито-хозяинных взаимоотношений.

Материал и методы

Исследования миксоспоридий плотвы проведены в ходе мониторинговых исследований паразитофауны рыб бассейна оз. Байкал: в Чивыркуйском заливе оз. Байкал 53°39’ N 109°00’ E в разные сезоны 2007–2018 гг. (200 экз. рыб).

Рыбы для исследования были выловлены жаберными сетями, взвешены, определены пол, возраст. Почки, селезенка, печень, мышцы, гонады, сердце, мозг были раздавлены между двумя стеклами; жабры, плавники, чешуя, глаза рыб были исследованы в чашке Петри с дистиллированной водой на наличие плазмодиев под стереомикроскопом МБС-10 при увеличении 10–25×.

Морфологические и гистологические исследования

Споры были выделены из разрушенных с помощью препаровальных игл плазмодиев под стереомикроскопом и затем заключены в глицерин-желатин [Донец, Шульман, 1973]. 50 спор были измерены с помощью программы Nikon-Elements BR. Все измерения были в микрометрах (μm), приведены средние значения и стандартное отклонение (SD).

Для гистологического исследования инфицированные органы были фиксированы в 10 %-ном забуференном формалине, заключены в парафин. Срезы окрашены гематоксилин-эозином, реактивом Шиффа, основным коричневым, по Маллори. Гистологический анализ был проведен с использованием светового микроскопа (Axio Imager M.2, Carl Zeiss; Germany).

Молекулярные исследования

Амплификация была проведена с помощью праймеров MyxospecF [Fiala, 2006] и 18R [Whipps et al., 2003], а также гнездовой ПЦР с праймерами 18e и 18g [Hillis and Dixon, 1991] первая амплификация и Myx1f + Act1R; ACT1f + Myx4R; Myx1F+Myx4R [Hallett and Diamant 2001] вторая амплификация.

ПЦР продукты были визуализированы в геле с помощью электрофореза, очищены PCR purification kit (CWBiotech), клонированы в вектор PMD18-T vector system (Takara), а также напрямую секвенированы с помощью BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit от Applied Biosystems (Thermo-Fisher Scientific) с использованием праймеров Myx1f, Myx4R на ABI3700 DNA analyzer from Applied Biosystems (Thermo-Fisher Scientific).

Результаты

У плотвы из Чивыркуйского залива оз. Байкал отмечено четыре вида миксо-споридий рода Myxobolus : Myxobolus feisti, M. diversicapsularis, M. pseudodispar, M. zaikae.

M. diversicapsularis Slukhai, 1966

В течение года мы отмечали цисты M. diversicapsularis летом в июне и июле. Паразит начинает регистрироваться у годовиков, экстенсивность инвазии у которых составляет 43 %, затем зараженность у рыб среднего и старшего возраста (3+–9+) увеличивается и достигает 100 % при средней интенсивности инвазии 23 экз.

Плазмодии локализуются в жаберных лепестках второго порядка. В начале июня в жабрах плотвы могут отмечаться как молодые плазмодии, имеющие размеры в диаметре 76,05±0,85 (65,15–105,78) µm, так и зрелые плазмодии размером 199±9,58 (137–242) µm. Спорообразование синхронное, плазмодий локализуется под эпителием, тесно прилегая к кровеносному сосуду. Целостность кровеносного сосуда не нарушается, воспалительная реакция отсутствует (рис. 1). У некоторых рыб наблюдается высокая зараженность жабр данным паразитом (более 20 цист на дужку), в таких случаях наблюдаются гистопатологические изменения. Плазмодии могут вызывать разрушение целостности и кровоизлияние капилляра и его полное уничтожение. Вокруг таких плазмодиев формируется капсула из воспалительных клеток, размеры таких цист — 446,4±27,4 (251–668) µm (рис. 2). В августе плазмодии M. diversicapsularis не отмечаются.

Рис. 1. Плазмодий (P) Myxobolus diversicapsularis в жабрах плотвы Rutilus rutilus .

Окраска гематоксилин-эозин. Шкала 50 µm

Последовательности нуклеотидов 18S rDNA, представленные в Генбанке под номерами MK100344, MK100345, имеют 100 %-ную идентичность с сиквен-сами этого же вида от плотвы из оз. Балатон (Венгрия) под номером GU968199 [Molnar et al., 2010].

Myxobolus pseudodispar Gorbunova, 1936

M. pseudodispar нами отмечен в мышцах, меланомакрофагических центрах кроветворных органов: почек, селезенки. У плотвы в оз. Байкал паразит встречается в течение всего года. В июле зараженность рыб M. pseudodispar в мышцах составляет 20 %, а в меланомакрофагических центрах — 65 %.

В мышцах летом плазмодии незрелые, споры начинают созревать в конце осени — зимой. Плазмодии небольшие, сигарообразные, локализуются в мышечном волокне, воспалительной капсулы нет (рис. 3). Размеры плазмодия колеблются в среднем от 150х40 µm до 370x80 µm. Ранней весной происходит созревание спор, плазмодии увеличиваются в размерах до 1 мм в длину. Часто происходит разрушение мышечных волокон, в этом случае возле плазмодиев скапливаются лейкоциты, споры оказываются в межмышечном пространстве, иногда формируется соединительнотканная капсула. Меланомакрофагические центры (МЦ) с M. pseudodispar в течение года меняются по структуре и форме. МЦ летом представляют собой конгломераты, состоящие из клеток мелано-макрофагов, содержащих липофусцин, между ними наблюдаются вкрапления спор M. pseudodispar. Зимой количество меланомарофагов уменьшается, между клетками образуется пространство с вакуолями, оно ШИК позитивно, содержит сульфатированные мукополисахариды. Сам МЦ окружен капсулой из тонких коллагеновых волокон. Споры немногочисленны. Кроме M. pseudodispar , в МЦ другие виды миксоспоридий не отмечены.

Последовательность нуклеотидов 18S rDNA MK100343, содержащая 1 714 п. о., имеет сходство на 99,3 % с сиквенсом KU340991 M. pseudodispar от плотвы из оз. Балатон, на 96,74 % с M. klamathellus, на 96,21 % с M. musculi.

Рис. 2. Плазмодий (P) Myxobolus diversicapsularis , окруженный соединительнотканной капсулой. Окраска по Маллори. Шкала 50 µm

Рис. 3. Поперечный срез мышечного волокна Rutilus rutilus .

Myxobolus pseudodispar (стрелка). Окраска гематоксилин-эозин. Шкала 25 µm

Myxobolus feisti Molnár et al., 2008

Паразит регистрируется у всех возрастных групп, кроме мальков, отмечается в течение всего года. У рыб в возрасте 4+–6+ зараженность в течение года остается стабильной, так, в 2000–2015 гг. зимой она составляла примерно около 30 %, весной 30–40 %, летом 20–30 %, осенью 20 %.

Плазмодии локализуются в хрящевой ткани жаберных лепестков, примерно на расстоянии 1–2 мм от конца жабер (рис. 4). Плазмодии продолговатой формы, воспалительная реакция отсутствует. Плазмодии могут быть довольно крупными, до 300 µm х 65 µm, и занимать практически всю ширину лепестка. Визуально плазмодий заметен только на просвет под стереомикроскопом, гипертрофия лепестка не отмечена. Довольно часто наблюдается сочетанная инвазия жабер M. feisti и M. diversicapsularis .

Последовательность нуклеотидов 18S rDNA MW237662, содержащая 845 п. о., имеет сходство на 99,53 % с сиквенсом JN252487 M. feisti от плотвы из оз. Балатон, на 96,92 % с M. macrocapsularis .

Рис. 4. Плазмодий Myxobolus feisti (P) в жабрах плотвы Rutilus rutilus .

Окраска гематоксилин-эозин. Шкала 50 µm.

Myxobolus zaikae Batueva, 2020

Морфология спор, гистологические особенности локализации вегетативных форм и молекулярные данные были представлены ранее [Batueva, 2020]. M. zaikae начинает регистрироваться у рыб с двухлетнего возраста. Экстенсивность инвазии рыб 2+–5+ не отличается существенными колебаниями (6–12 %) и далее у рыб в возрасте 5+–8+ наблюдается увеличение показателей зараженности (25–40 %). Паразит встречается в течение всего года. Зимой отмечена максимальная экстенсивность инвазии и индекс обилия (86,6% и 11,73 экз.). Процент зараженности снижается весной (19 %) и летом (20 %) почти в 5 раз. Индекс обилия в эти сезоны остается одинаково низким. Осенью показатели зараженности незначительно повышаются до 33 %. Вокруг плазмодиев отсутствует соединительнотканная капсула. Спорообразование синхронное, споры созревают в конце осени — зимой.

Обсуждение

Плотва — евроазиатский вид с очень обширным непрерывным ареалом от Пиренеев до Лены. У плотвы в прошлом веке было отмечено более 20 видов миксоспоридий [Шульман, 1966]. Большинство видов имело широкую госталь-ную специфичность и было характерным для многих карповых рыб Евразии. Идентификация видов основывалась на морфологию спор. Учитывая, что округлые споры рода Myxobolus имеют сходные и слабо различимые морфологические признаки, множество видов было объединено в один, например M. muelleri и M. bramae [Определитель, 1984]. Также и нами ранее при рутинном изучении паразитофауны плотвы в оз. Байкал были ошибочно определены виды рода Myxobolus [Дугаров и др., 2011].

Позже с использованием молекулярных методов исследования К. Мольнаром и др. [Molnár et al., 2011] у плотвы было выявлено 8 видов миксоспоридий, из которых 5 видов новые для науки. Из этих видов на Байкале у плотвы найдено нами лишь три вида ( M. diversicapsularis , M. feisti , M. pseudodispar ), остальные виды M. rutili , M. fundamentalis , M. sommervillae , M. wootteni , M. intimus не обнаружены. Причем M. intimus является распространенным паразитом ельца сибирского в оз. Байкал, у которого он и был впервые описан В. Е. Заикой (1965). Споры M. zaikae внешне сходны с M. muelleri , однако различия в локализации и последовательности нуклеотидов 18S рДНК говорят, что это разные виды. Одним из самых изученных миксоспоридий является M. pseudodispar — криптический вид, характерный для карповых паразитов. У M. pseudodispar высокие генетические различия (до 96 % различий по 18S rDNA) в зависимости от гостальности [Forro, Ezster-bauer, 2016; Lisnerova et al., 2020]. Поиск гомологов по программе BLAST выявил, что сиквенс изолята M. pseudodispar из оз. Байкал сходен с изолятом KU340991. Хотя оба изолята выделены у плотвы, находятся они вне единого кластера плотвичных изолятов M. pseudodispar [Forro, Ezsterbauer, 2016].

Гистологические особенности локализации M. pseudodispar были подробно описаны Ф. Баской [Baska, 1987] и К. Мольнаром и др. [Molnár et al., 2014], отмечается, что паразит развивается в скелетных мышечных клетках, по мере созревания спор нередко происходит воспалительная реакция и инкапсуляция паразита. У миксоспоридий M. pseudodispar , M. cyprini , M. musculi , локализующихся в мышечных волокнах, споры часто аккумулируются в меланомакрофагических центрах [Dyková, 1984; Molnár & Kovács-Gayer, 1985; Baska, 1987]. А. Хольцер и О. Шахнер [Holzer & Schachner, 2000] при изучении M. cyprini в МЦ выявило наличие вегетативных форм паразита. Авторами также отмечена высокая зараженность M. cyprini в МЦ. Наши исследования подтверждают данный факт и свидетельствуют, что МЦ также может быть местом паразитирования M. pseudodispar . Однако все еще остаются неясными механизмы попадания M. pseudodispar в МЦ и причины несинхронного развития вегетативных форм в течение года в мышцах и в МЦ.

Для жаберных паразитов M. diversicapsularis и M. feisti плотва типовой хозяин. M. diversicapsularis паразитирует в жабрах рыб практически всех возрастов. Цикл развития довольно короткий — конец весны — начало лета, что позже на месяц, чем в оз. Балатон [Molnár et al., 2010], вероятно, причина связана с различием в температуре воды в весенне-летний период.

Плазмодии M. feisti в первоописании [Molnár et al., 2008] отмечены в жабрах только у годовиков плотвы. Поскольку плазмодий M. feisti может оккупировать только небольшое пространство жаберного хряща, размеры плазмодиев, описанных К. Мольнаром и др. [Molnár et al., 2008], у молодых рыб были значительно меньше, чем выявлено нами у рыб старшего возраста. Различия в тканевом тропизме M. feisti и M. diversicapsularis не вызывают межвидовой конкуренции в жабрах.

Выводы

У плотвы из Чивыркуйского залива оз. Байкал отмечено меньше видов (4), чем у плотвы из оз. Балатон (8). У всех обнаруженных видов плотва является типовым хозяином. Нет генетической и морфологической изменчивости видов миксоспори-дий в разных концах ареала хозяина. Зараженность плотвы на Байкале миксоспо-ридиями выше, чем отмечено в оз. Балатон (Венгрия), ярко выражен патогенный характер при гиперинвазии. Плотва в бассейне оз. Байкал находится на восточной границе своего ареала, поэтому обеднение паразитофауны плотвы, а также увеличение зараженности плотвы видами Myxobolus spp. коррелирует с общими законами в паразитологии [Догель, 1962].