Особенности ремоделирования суставных структур при протезировании смежного сегмента конечности имплантатом с кальций-фосфатным покрытием

Остеоинтегративное экзопротезирование конечностей представляет собой передовую технологию восстановления утраченных конечностей путем интеграции металлического имплантата с костной тканью культи, обеспечивая стабильное и функциональное соединение [1, 2, 3, 4]. Преимущества данного метода включают улучшение функциональности и качества жизни пациентов, сенсорной обратной связи (остеоперцепция и остеопроприорецепция), долгосрочное функционирование и устранение проблем, связанных с традиционными гильзовыми протезами (раздражение кожи, плохое прилегание, высокая частота боли в костях и/или мягких тканях, аллергические реакции, снижение функции и дальнейшее ухудшение качества жизни) [5, 6, 7, 8, 9].

Современные исследования по улучшению остеоинтегративных свойств имплантатов направлены на повышение эффективности срастания костной ткани с имплантатом путем модификации его поверхности (микротекстурирование, наноструктурные и биологически активные покрытия), стимуляции остеогенеза (электростимуляция, применение препаратов, стимулирующих минерализацию) [10, 11, 12, 13].

Установлено, что имплантаты с кальций-фосфатным покрытием обладают высокой биосовместимостью, ускоряют процесс остеоинтеграции [14, 15].

Исследования на животных показали, что в смежном суставе через шесть месяцев после протезирования голени имплантатом типа PressFit структурные изменения суставного хряща соответствовали степени 0–1 по классификации Международного общества изучения остеоартроза OARSI [16]. Структурные изменения субхондральной зоны по классификации O-M. Aho et al. [17] соответствовали стадии 0, — «очень ранние признаки остеоартроза» [18]. При установке имплантатов с кальцийфосфатным покрытием в выше расположенном суставе процессы резорбции субхондральной кости и истончение суставного хряща были выражены в меньшей степени по сравнению с имплантатами без покрытия [19].

У пациентов, перенесших ампутацию конечности, распространенным осложнением после протезирования являются контрактуры и артроз в смежном суставе, возникающие из-за таких факторов как повышенная нагрузка на сустав, нарушение биомеханики, длительная неподвижность суставов, мышечная слабость и воспалительная реакция организма на имплантаты [20, 21].

Нарушение нормальной биомеханики сустава, наличие очагов инфекции, которые встречаются после протезирования конечности [5], относятся к основными причинами развития синовита [22].

Изучение особенностей структурной реорганизации компонентов смежного с протезом сустава и определение предикторов артроза являются залогом успешного восстановления функции протезируемой конечности и долгой службы протеза.

Цель работы — оценить структурную реорганизацию основных компонентов сустава в отдаленные сроки после протезирования голени имплантатом с кальций-фосфатным покрытием.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Исследование выполнено на 11 беспородных собаках (самцы) в возрасте (1,8 ± 0,5) лет, с массой тела (19,0 ± 1,2) кг. Опытным животным ( n = 6) моделировали культю большеберцовой кости на уровне верхней трети диафиза. Через 2,5 месяца устанавливали имплантат из сплава Ti6Al4V с кальцийфосфатным покрытием (Патент на полезную модель РФ № 194912, [23]). Затем с помощью аппарата Илизарова и специального устройства (Патент РФ №185647, [24]) имплантат фиксировали и создавали компрессию на кость (Fн = 20 Н) в течение 35 дней после операции, затем устанавливали экзопротез. Этапы исследования — шесть и 12 месяцев после протезирования.

Объекты исследования : синовиальная оболочка, суставной хрящ и субхондральная зона большеберцового плато.

В качестве контроля исследовали синовиальную оболочку, суставной хрящ и субхондральную зону большеберцового плато пяти интактных собак.

Этические принципы

Исследование проведено в соответствии с правилами Европейской конвенцией (ETS № 123) о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях и межгосударственным стандартам (ГОСТ 33044-2014). Исследование одобрено локальным этическим комитетом (протокол от 29.11.2024 № 1(76)).

Эвтаназия

Эвтаназию осуществляли после миорелаксации раствором димедрола 1 % (0,02 мг/кг) и рометара 2 % (5 мг/кг) введением летальной дозы барбитуратов.

Гистологические методы исследования

Для гистоморфометрического исследования вскрывали коленный сустав, иссекали фрагменты синовиальной оболочки, с нагружаемых участков большеберцового плато вырезали образцы суставного хряща с подлежащей субхондральной костью. Вырезанные костно-хрящевые блоки фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина, затем декальцинировали в смеси растворов муравьиной и соляной кислот (применяли стандартный протокол щадящей декальцинации, при котором декальцинация значимо не влияла на тинкториальные свойства костного матрикса). Дальнейшие этапы парафиновой проводки костно-хрящевых блоков осуществляли в аппарате для вакуумной проводки тканей HISTOSAFETM INFILTRATM (ООО «ЭргоПродакшн», Россия). Срезы толщиной 5–7 мкм с парафиновых блоков изготавливали на микротоме НМ 450 Thermo Scientific (США), затем окрашивали гематоксилином и эозином, для выявления степени минерализации костного матрикса применяли специальную окраску трехцветным методом по Массону [25].

Для анализа ангиогенеза проводили иммуногистохимическое исследование на определение наличия маркера CD34 (моноклональные антитела кролика к CD34 [EP373Y]) (Abcam, Великобритания). Для визуализации реакции применяли набор реагентов для иммуногистохимической детекции HRP/DAB (ab236469 — Rabbit specific HRP/DAB Detection IHC Detection Kit-Micropolymer, Abcam, Великобритания). Все этапы постановки реакции проводили согласно протоколу фирмы-производителя антител. Срезы докрашивали гематоксилином.

Образцы синовиальной оболочки после альдегидно-осмиевой фиксации обезвоживали и заключали в двухкомпонентную эпоксидную смолу. Полутонкие (0,5–1,0 мкм) срезы (4–8 мм2) готовили на ультрамикротоме Nova (LKB, Швеция), окрашивали метиленовым синим и основным фуксином.

Исследование на светооптическом уровне производили с помощью микроскопа AxioScope.A1 с цифровой камерой AxioCam (CarlZeissMicroImagingGmbH, Германия).

При гистоморфометрии с использованием ПО Zenblue (CarlZeissMicroImagingGmbH, Германия) в суставном хряще определяли параметры: толщина некальцифицированного хряща (h uncal.cr , мкм), толщина кальцифицированного хряща (h cal.cr , мкм). В глубокой зоне некальцифицированного хряща оценивали частоту встречаемости сосудов (отношение суммы сосудов в полях зрения к количеству всех анализируемых полей зрения), от каждого животного анализировали в среднем 20 полей при увеличении 400×. В субходральной зоне определяли толщину субхондральной костной пластики (h CtTh , мкм), рассчитывали костный индекс как отношение толщины трабекул (TbTh, мкм) к ширине межтрабекулярных пространств (ItTh, мкм).

Выраженность структурных изменений суставного хряща оценивали согласно гистологической классификации OARSI [16], структурные изменения субхондральной зоны — по классификации O-M. Aho et al. [17], выраженность воспалительного процесса в синовиальной оболочке — по шкале V. Krenn et al. [26].

Статистические методы

Количественные данные обрабатывали в табличном процессоре Microsoft Exсel. Оценку типа распределения выборок проводили с помощью критерия Колмогорова. Мера центральной тенденции параметров представлена в виде медианы и квартилей, минимальных и максимальных значений (Me ( р 25– р 75) [min–max]) и в виде средней и ошибки средней (М ± m). Для анализа различий сравниваемых групп использовали критерий Манна – Уитни, для частотных показателей — критерий Барнарда, значимыми считали различия при р < 0,05 (программа AtteStat, версия 9.3.1).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Структурная реорганизация синовиальной оболочки

Через шесть месяцев эксперимента в синовиальной оболочке в покровном слое синовиальные клетки располагались в один–три слоя, преобладали макрофагоподобные синовиоциты, такие клетки имели овоидное ядро, цитоплазматические выросты, базофильную цитоплазму, содержащую множество гранул и вакуолей (рис. 1, а). В поверхностном коллагеново-эластическом слое преобладали коллагеновые волокна, клеточность была умеренно повышена, наряду с фиброцитами и фибробластами регистрировали плазматические клетки, скопления тучных клеток (рис. 1, б). В глубоком коллагеново-эластическом слое регистрировали сосуды с утолщенными стенками за счет гипертрофии гладкомышечных клеток, в отдельных сосудах набухшие ядра эндотелиальных клеток перекрывали внутрисосудистое пространство (рис. 1, в).

Через 12 месяцев эксперимента отмечали участки утолщения покровного слоя, в которых синовиальные клетки располагались в три–четыре слоя, основная часть синовиоцитов — с признаками деструкции, аномальной формы с пикнотичными ядрами (рис. 1, г). В поверхностном коллагеновоэластическом слое сохранялись нормальная клеточность и единично расположенные фибробласты, фиброциты (рис. 1, д), отмечено увеличение оптических пустот между волокнами. В глубоком коллагеново-эластическом слое сосуды — с утолщенными стенками и стенозом (рис. 1, е).

Рис.1. Синовиальная оболочка коленного сустава. Срок эксперимента: а, б, в — шесть месяцев; г, д, е — 12 месяцев. В покровном слое преобладают макрофагоподобные синовиоциты (а), деструктивно измененные синовиоциты (г). В верхнем коллагеново-эластическом слое фибробласты, фиброциты, тучные и плазматические клетки (б), фиброциты (д). Изменения сосудов в глубоком коллагеново-эластическом слое (в, е). Полутонкие срезы. Окраска метиленовым синим и основным фуксином. Увеличение ×1000

Структурная реорганизация суставного хряща

Суставной хрящ мыщелков большеберцовой кости в эксперименте, как и в контроле, сохранял зональное строение, четко определялись все зоны хряща. В поверхностной зоне через шесть месяцев эксперимента в большей части наблюдений отмечено уменьшение доли клеточного компонента и увеличение доли бесклеточных полей, нарушение гомогенности межклеточного вещества (рис. 2, б). Через 12 месяцев эксперимента в одном наблюдении из трех отмечена инвазия синовиального паннуса в поверхностную зону хряща, пустые клеточные лакуны (рис. 2, в).

Рис. 2. Поверхностная и часть промежуточной зоны латерального мыщелка большеберцовой кости: а — контроль (интактная норма); б — шесть месяцев эксперимента, демаскировка коллагеновых волокон, бесклеточные поля в поверхностной и промежуточной зонах; в — 12 месяцев эксперимента, прорастание синовиального паннуса. Парафиновые срезы, окраска трехцветным методом по Массону. Увеличение ×400

На протяжении всего эксперимента в промежуточной и глубокой зонах сохранена цитоархитектоника, отмечены бесклеточные поля, часть клеток — с признаками хондроптоза. Регистрировали участки нарушения непрерывности базофильной линии и инвазию сосудов и костно-мозгового паннуса в глубокую зону некальцифицированного хряща (рис. 3). Частота встречаемости сосудов в глубокой зоне через шесть месяцев эксперимента составила (0,35 ± 0,02), через 12 месяцев — (0,30 ± 0,02), различия статистически незначимы ( р = 0,736).

Рис. 3. Экспрессия CD34 в эндотелии сосудов (коричневый цвет осадка). Нарушение непрерывности базофильной линии, инвазия сосудов в глубокую зону хряща:

а — шесть месяцев эксперимента;

б —12 месяцев эксперимента. Парафиновые срезы. Увеличение ×400

Структурная реорганизация субхондральной зоны

У интактных животных (контроль) субхондральная костная пластинка — неравномерной толщины, непрерывна, в костном матриксе при окрашивании трехцветным методом по Массону преобладали фуксинофильные структуры (рис. 4, а). В экспериментальной серии толщина субхондральной костной пластинки варьировала, в шесть месяцев эксперимента чаще выявляли участки истончения, в 12 месяцев эксперимента — участки утолщения. При окраске трехцветным методом по Массону через шесть месяцев отмечали снижение доли фуксинофильных структур (рис. 4, б), а через 12 месяцев доля фуксинофильных структур вновь возрастала (рис. 4, в), что косвенно свидетельствовало о повышении минерализации костного матрикса.

На протяжении всего эксперимента регистрировали участки субхондральной костной пластинки, выстланные активными остеобластами, продуцирующими основное вещество (рис. 4, б, в).

Рис. 4. Контакт кальцифицированного хряща с субхондральной костной пластинкой: а — контроль; б — шесть месяцев эксперимента; в — 12 месяцев эксперимента. Обозначения: 1 — глубокая зона некальцифициро-ванного хряща; 2 — кальцифицированный хрящ; пунктирная линия — границы субхондральной костной пластинки; сплошные стрелки — базофильная линия; пунктирные стрелки — остеобласты. Парафиновые срезы. Окраска трехцветным методом по Массону. Увеличение ×400

В субхондральной трабекулярной кости на всех этапах эксперимента отмечены признаки репаративного остеогенеза, — активные остеобласты, выстилающие поверхности костных трабекул (рис. 5). Сеть костных трабекул — разряженная, поверхности трабекул частично выстланы остеобластами (рис. 5, а). При окрашивании трехцветным методом по Массону матрикс костных трабекул имеет преимущественно красный цвет (рис. 5, б). Костных трабекулы и субхондральная костная пластинка утолщены (рис. 5, в). На поверхности костной трабекулы присутствуют остеобласты (рис. 5, г).

Гистоморфометрический анализ через шесть месяцев эксперимента не выявил относительно контроля статистически значимых различий значений параметров толщины некальцифицированного и кальцифицированного хряща, отмечено статистически значимое снижение толщины субхондральной костной пластинки, различия значений костного индекса в субхондральной трабекулярной кости — на уровне статистической тенденции (табл. 1).

Через 12 месяцев эксперимента при сравнении с контролем регистрировали статистически значимое снижение значений толщины некальцифицированного хряща, увеличение значений толщины кальцифицированного хряща на уровне статистической тенденции. В субхондральной зоне медиана толщины субхондральной костной пластинки больше контроля на 33 %, медиана костного индекса в субхондральной трабекулярной кости на 31 %, различия с контролем — на уровне статистической тенденции, различия между сроками эксперимента статистически значимы (табл. 1).

Таблица 1

Гистоморфометрические характеристики суставного хряща и субхондральной зоны большеберцовой кости на этапах эксперимента и в контроле (Me (Q1; Q3) [min–max])

Параметры	Показатели
	Контроль	6 мес. эксперимента	12 мес. эксперимента
Толщина некальцифицированного хряща (h uncal.cr , мкм)	1,28 (1,21; 1,33) [1,16–1,66]	1,24 (1,18; 1,32) [1,15–1,79] р = 0,5823	1,15 (1,09; 1,18) [1,01–1,24] р = 0,0013; р 1 = 0,0045
Толщина кальцифицированного хряща (h cal.cr , мкм)	125,93 (104,68; 135,66) [95,98–173,84]	120,34 (105,43; 129,24) [75,36–189,76] р = 0,9081	154,46 (132,39; 155,83) [89,14–190,83] р = 0,0576; р 1 = 0,1552
Толщина субхондральной костной пластики (h CtTh , мкм)	144,11 (87,55; 205,31) [60,92–223,87]	97,44 (87,97; 172,96) [60,92–167,86] р = 0,0105	195,21 (125,77; 216,51) [69,52–284,78] р = 0,1293; р 1 = 0,0068
Толщина трабекул (TbTh, мкм)	156,47 (81,95; 234,91) [28,23–281,94]	112,91 (70,35; 140,54) [56,82–195,12] р = 0,2801	189,69 (163,06; 195,93) [64,36–436,09] р = 0,0556; р 1 = 0,0113
Ширина межтрабекулярных пространств (ItTh, мкм)	267,09 (175,78; 311,26) [105,65–729,22]	312,69 (176,28; 402,02) [54,13–718,13] р = 0,9181	216,58 (160,04; 230,24) [62,92–429,26] р = 0,0552; р 1 = 0,0598
TbTh / ItTh	0,69 (0,31; 0,75) [0,26–2,66]	0,56 (0,25; 0,73) [0,14–1,97] р = 0,3284	0,91 (0,48; 0,82) [0,27–2,82] р = 0,0571; р 1 = 0,0261

Примечание: р —уровень значимости отличий при сравнении с контролем, р ¹ — уровень значимости отличий между сроками эксперимента по критерию Манна – Уитни, при р ≤ 0,05. Жирным шрифтом выделены статистически значимые отличия, курсивом — отличия на уровне статистической тенденции.

б                                       в

Рис. 5. Субхондральная трабекулярная кость, шесть месяцев эксперимента (а, б), 12 месяцев эксперимента (в, г): а — разряженная сеть костных трабекул, часть поверхностей трабекул выстлана остеобластами; б — остеобласты на поверхности трабекулы, продуцирующие костный матрикс (синий цвет); в — утолщение костных трабекул и субхондральной костной пластинки; г — остеобласты на поверхности костной трабекулы. Парафиновые срезы, окраска гематоксилином и эозином (а, в, г), трехцветным методом по Массону (б). Увеличение ×100 (а, в), ×400 (б, г)

При использовании морфологических шкал оценка синовиальной оболочки по шкале V. Krenn et al. [26] указывала на слабо выраженный синовит у всех животных через шесть месяцев эксперимента и в 30 % наблюдений через 12 месяцев эксперимента (в 70 % наблюдений синовит не выявлен). Структурные изменения суставного хряща по шкале OARSI [16] через шесть месяцев эксперимента в большей части наблюдений соответствовали 1 степени (в 30 % — нулевой степени), через 12 месяцев в 70 % наблюдений — 1 степени, в 30 % — 2 степени. Структурные изменения субхондральной зоны по шкале O-M. Aho et al. [17] через шесть месяцев эксперимента соответствовали нулевой степени, — «очень ранние изменения», когда субхондральный склероз отсутствует, а субхондральная костная пластинка истончена. Через 12 месяцев эксперимента увеличение медианы толщины субхондральной костной пластинки и увеличение объёма трабекулярной кости свидетельствовали об очаговом субхондральном склерозе и соответствовали 1 степени (табл. 2).

Таблица 2

Анализ результатов оценки структурных изменений компонентов сустава на этапах эксперимента

№ опытного животного	Срок эксперимента	Показатели
		Шкала V. Krenn et al., баллы	Шкала OARSI, степень	Шкала O-M Aho et al., степень
1	6 мес.	2	0	0
2	6 мес.	2	1	0
3	6 мес.	3	1	0
4	12 мес.	2	2	1
5	12 мес.	1	1	1
6	12 мес.	1	1	1

ОБСУЖДЕНИЕ

В выполненном исследовании впервые проведена комплексная оценка структурной реорганизации основных компонентов сустава при экзопротезировании смежного сегмента конечности имплантатом с кальций-фосфатным покрытием в отдаленные сроки после протезирования.

Согласно современным представлениям, первоначальные изменения при остеоартрите, возникающие при макро- или микроповреждениях, происходят на молекулярном уровне, активируют патологические адаптивные восстановительные ответы, включая провоспалительные пути иммунной системы [27]. Известно, что синовиальная среда при остеоартрите характеризуется гиперплазией синовиальной оболочки, формированием синовиального паннуса, увеличением представительства макрофагоподобных синовиоцитов, повышенной инфильтрацией иммунных клеток. М1-поляризованные макрофаги и активированные фибробластоподобные синовиоциты и фибробласты продуцируют провоспалительные цитокины, которые, в свою очередь, отвечают за повышенный синтез и экспрессию матриксных металлопротеиназ, разрушающих суставной хрящ [28, 29]. Одновременно с изменениями в хряще регистрируют структурные изменения в подлежащей субхондральной зоне, склероз субхондральной кости, обширное ремоделирование трабекул, образование очагов некроза и остеофитов в краевых участках сустава [30].

Как показало данное исследование, через шесть месяцев после протезирования в смежном суставе в большей части наблюдений выявлен слабо выраженный синовит, который выражался гиперплазией покровного слоя, увеличением представительства макрофагоподобных синовиальных клеток, наличием в субсиновиальном слое плазматических и тучных клеток. На протяжении всего эксперимента регистрировали гистологические признаки нарушения кровоснабжения синовиальной оболочки (сужение просветов сосудов микроциркуляторного русла). Слабо выраженный синовит, выявленный в шесть месяцев эксперимента, через 12 месяцев в большей части наблюдений имел обратимый характер (сохранялся в одном наблюдении и сопровождался инвазией синовиального паннуса в поверхностную зону суставного хряща).

Гистологические признаки воспаления синовиальной оболочки в данных условиях эксперимента характерны для неинфекционного синовита [26] и могут быть обусловлены повреждением нервных волокон и/или нарушением биомеханики сустава.

При изучении биомеханических факторов остеоартрита коленного сустава E.R. Esposito et al. показали, что у пациентов с транстибиальной ампутацией повышен риск развития данного заболевания [31].

Воспаление и нарушение кровоснабжения синовиальной оболочки оказывают негативное влияние на структуру суставного хряща посредством нескольких механизмов, включая высвобождение воспалительных медиаторов, нарушение транспорта питательных веществ и вывода продуктов обмена веществ посредством диффузии [32].

На протяжении всего эксперимента отмечено врастание сосудов со стороны субхондральной зоны в глубокую зону некальцифицированного хряща. Проникновение кровеносных сосудов в хрящ является патологическим процессом, который может привести к его разрушению и замещению фиброзной и/или костной тканью. Антиангиогенные факторы, вырабатываемые хондроцитами, помогают предотвратить этот процесс. Установлено, что тяжесть повреждения суставного хряща коррелирует с количеством вновь образованных кровеносных сосудов [33, 34].

Гистоморфометрически к концу эксперимента зарегистрировано статистически значимое относительно контроля снижение значений толщины некальцифицированного хряща, при этом статистически значимо больше были значения толщины кальцифицированного хряща. В субхондральной зоне значения морфометрируемых параметров широко варьировали как в контроле, так и на протяжении всего эксперимента. К концу эксперимента медианы параметров «толщина субхондральной костной пластинки», «костный индекс в субхондральной трабекулярной кости» были больше контроля. Обнаруженная разница значений параметров толщины субхондральной костной пластинки и костного ин- декса субхондральной зоны по сравнению с контролем не является статистически значимой, но имеет тенденцию к проявлению (р < 0,1), что требует проведения дальнейших исследований большего размера выборки для подтверждения или опровержения этой тенденции.

При окраске трехцветным методом по Массону в субхондральной костной пластинке и субхондральной трабекулярной кости преобладали фуксинофильные структуры, поверхности костных трабекул выстилали активные остеобласты, что косвенно свидетельствовало о положительном влиянии кальций-фосфатного покрытия имплантата на процессы репаративного остеогенеза и минерализацию костного матрикса.

Субхондральный склероз при остеоартрите является результатом компенсаторно-адаптационных реакций в ответ на снижение минерализации костного матрикса, направленных на поддержание структуры гиалинового хряща при механической нагрузке и предотвращение его дальнейшей деструкции [35, 36]. Ключевым фактором остеоартрита является не сам субхондральный склероз, а усиленное ремоделирование костной ткани, снижение минерализации костного матрикса [35, 37]. Выявленные в данном исследовании гистологические признаки воспаления и нарушения кровоснабжения синовиальной оболочки, инвазия синовиального паннуса в поверхностную зону хряща, истончение суставного хряща, проникновение сосудов в глубокую зону некальцифицированного хряща со стороны субхондральной зоны являются прогностическими гистологическими маркерами остеоартрита.

Полученные знания о структурной реорганизации основных компонентов смежного с протезом сустава в отдаленные сроки после протезирования имеют большое значение для разработки оптимальной терапевтической стратегии, направленной на замедление прогрессирования остеоартрита.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Структурные изменения костно-хрящевого компонента большеберцового плато через год после протезирования голени имплантатом с кальций-фосфатным покрытием соответствовали начальной стадии остеоартрита. Неинфекционный синовит слабой степени выраженности в большей части наблюдений имел обратимый характер. Применение имплантатов с кальций-фосфатным покрытием способствовало активации процессов репаративного остеогенеза и минерализации костного матрикса в субхондральной зоне.