Отбор толерантных к пепельной гнили генотипов сои на основе онтогенетической динамики осмотического давления клеточного сока

Введение. Более ранние исследования такого заболевания, как пепельная гниль сои, позволили установить, что нарушение осмо-трофного питания возбудителя болезни – гриба Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. на любом этапе онтогенеза растения, например из-за засухи, вызывает формирование микро-склероциев патогена во всех местах локализации мицелия в тканях растения-хозяина. Наиболее вредоносным является образование микросклероциев в сосудах метаксилемы, вызывающее их закупорку и гибель растений сои

[1, 3].

Подтверждением определяющей роли осмотического давления клеточного сока (ОДКС)

сои при формировании микросклероциев пепельной гнили явилось установление фактов максимального поражения этим патогеном сортообразцов сои со сверхкритическими (более 930 кПа) значениями ОДКС, а также минимального поражения генотипов с докритическими значениями этого показателя на этапах онтогенеза от бутонизации до полного налива семян [2].

Задачей настоящих исследований явилась разработка метода выделения исходного материала для селекции сои с повышенной устойчивостью к возбудителю пепельной гнили M. phaseolina

Методы исследований. Объектом изучения в данной работе являются гриб Mac-rophomina phaseolina (Tassi) Goid., поражающий сою, а также рабочая коллекция сои ВНИИМК.

Для понимания осмотрофных процессов в системе патоген – растение-хозяин были проведены исследования динамики осмотического давления клеточного сока (ОДКС) в онтогенезе, как в тканях возбудителя пепельной гнили, так и в тканях сои. С этой целью на рефрактометрах ИРФ-22 и PR-101 a оценивали ОДКС у отобранных сортообразцов сои по методике Н.Н. Третьякова [4].

В опыте оценивали генотипы с различной устойчивостью к пепельной гнили из рабочей коллекции сои разных групп спелости, поддерживающейся в отделе сои ВНИИМК. Для этого на пяти растениях каждого исследуемого генотипа в период полного налива семян измельчали нижние междоузлия и при помощи ручного пресса получали сок из каждого образца стебля. На рефрактометре определяли концентрацию клеточного сока. Для каждого варианта выполняли не менее 2-3 повторений. По специальной таблице находили величину осмотического давления, соответствующую найденной концентрации клеточного сока [4]. Осмотическое давление клеточного сока (ОДКС) в тканях растений сои определяли по рассчитанной нами ранее эмпирической формуле 1, обеспечивающей функциональную взаимосвязь ( r = 1,0) между концентрацией клеточного сока и ОДКС.

у = 14,5527 + (69,4075 х Кс) + (1,2437 х Кс2) (1), где: y – осмотическое давление клеточного сока, кПа;

Кс – концентрация клеточного сока, %.

Результаты и обсуждение. Известные в физиологии растений методы определения осмотического давления клеточного сока, основанные на выдерживании высечек листовых пластинок в серии растворов с разной концентрацией осмотически активных веществ, оказались практически непригодны для решения поставленных в наших экспериментах задач. Эти методы, во-первых, были адаптированы под оценку ОДКС в клетках листьев и не позволяли определить ОДКС в тканях стеблей; во-вторых, на проведение одного анализа требовалось до 30 мин и набор из 5-10 ёмкостей с растворами различной концентрации осмотика. В связи с этим за основу полевого экспресс-метода был взят рефрактометрический анализ, основанный на методике Н. Н. Третьякова [4], позволяющий определить ОДКС через концентрацию растворённых в клеточном соке веществ.

При помощи ручного пресса получали клеточный сок из каждого образца. На рефрактометре определяли показатель его преломления с учётом температурного коэффициента. Затем по разработанной на основе справочных таблиц Н.Н. Третьякова эмпирической формуле 1 находили величину осмотического давления, соответствующую найденной концентрации клеточного сока.

Ручной пресс для полевого экспресс-метода был специально изготовлен в мастерских отдела механизации ВНИИМК (рис. 1).

а

б

Рисунок 1 – Ручной пресс для отжима клеточного сока из стеблей сои:

а – общий вид пресса; б – рабочая камера пресса с поршнем

За основу была взята стандартная конструкция бытового ручного пресса для чеснока. Однако общие размеры пресса и длина рычагов были увеличены в два раза, что позволяло увеличить степень сжатия растительных об- разцов. Также был увеличен объём прессовой камеры.

Технология экспресс-метода определения ОДКС в тканях стеблей сои включала следующие этапы:

• 1.    Отбор 3-5 типичных растений на каждой делянке на расстоянии не менее 0,5 м от её края;

• 2.    Измельчение секатором стеблей отобранных растений до полного заполнения рабочей камеры пресса;

• 3.    Отжим ручным прессом 1-3 мл клеточного сока из измельчённых стеблей сои;

• 4.    Определение концентрации клеточного сока, помещённого на призму рефрактометра ИРФ-22 или в рабочую камеру рефрактометра PR-101 a (рис. 2);

• 5.    Расчёт ОДКС всех образцов в лабораторных условиях по эмпирической формуле 1.

Рисунок 2 – Определение концентрации клеточного сока на рефрактометре PR-101a жающей температуры и содержания влаги питательным субстратом [5, 6, 7, 8].

В полевых условиях массовое формирование микросклероциев в тканях сои определяется достижением критических и сверхкритических концентраций клеточного сока растения-хозяина. В свою очередь, на уровень ОДКС тканей сои большое влияние должны оказывать температура окружающей среды и объём запасов влаги в почве. Повышение температуры воздуха, особенно в условиях засухи, должно способствовать усилению транспирации воды из сои, и, следовательно, повышению концентрации клеточного сока. Причем в зависимости от удалённости различных частей растений от корневой системы, с одной стороны, и приближённости тканей к испаряющим органам, с другой стороны, степень оводнённости тканей может быть различна. Очевидно, что суточные колебания температур воздуха также будут оказывать некоторое модифицирующее влияние на ОДКС тканей сои.

Поэтому первым обязательным этапом разработки метода контроля ОДКС в тканях сои стали исследования суточного ритма колебаний концентрации клеточного сока. Для этого во второй декаде июля в течение полных суток оценивали ОДКС в тканях нижнего, среднего и верхнего ярусов растений раннеспелого сорта Лира и среднеспелого сорта Парма. Интервал между определениями ОДКС – 3 часа.

В день проведения эксперимента минимальная температура воздуха в 6 ч утра составила 21,4 °С (рис. 3). В это же время

Хронометраж времени показал, что на выполнение первых четырёх этапов при определении концентрации клеточного сока в одном сортообразце требуется не более 3-5 мин. Таким образом, используемый экспресс-метод позволяет за 4 часа в поле определить ОДКС 40-50 сортообразцов.

Следующим этапом реализации гипотезы осмотически зависимого образования микро-склероциев у пепельной гнили явилась разработка метода контроля концентрации клеточного сока в тканях растений в критические для проявления болезни фазы онтогенеза. Известные из литературы, а также полученные в наших исследованиях экспериментальные данные свидетельствуют о зависимости образования микросклероциев от внешних условий, прежде всего, от окру-

Рисунок 3 – Суточная динамика температуры и относительной влажности воздуха, в течение 16.07.2007 г., Краснодар, метеостанция «Круглик»

относительная влажность воздуха была максимальной и составляла 43 %. По мере восхода солнца и прогревания воздуха температура возрастала и в период 15-16 ч достигла суточного максимума 33,6 °С, относительная влажность воздуха в это время была минимальной и составила 24 %.

Растения раннеспелого сорта сои Лира на дату определения суточной динамики ОДКС (16 июля 2007 г.) полностью завершили свой рост и находились в фазе налива семян.

Анализ данных ОДКС в разное время суток показал их существенную зависимость от температуры воздуха (табл. 1).

Минимальные значения ОДКС тканей (510-540 кПа) были отмечены в ночные и утренние часы на фоне минимальной температуры и максимальной относительной влажности воздуха. При этом максимальные значения ОДКС (950 кПа) были установлены в 15 ч дня на фоне максимальной температуры и минимальной влажности воздуха.

Коэффициент корреляции Пирсона между суточной динамикой температур воздуха и ОДКС тканей нижнего, среднего и верхнего ярусов растений составил 0,57, 0,74 и 0,73 соответственно.

Таблица 1

Суточный ритм осмотического давления клеточного сока раннеспелого сорта Лира в фазе налива семян, кПа

Время измерения ОДКС, ч	ОДКС тканей стебля по ярусам растения			Отклонения ОДКС от среднесуточных значений, %
	нижний	средний	верхний	нижний ярус	средний ярус	верхний ярус
0	510	670	720	-25,7	-2,3	5,0
3	620	650	640	-10,3	-6,0	-6,7
6	540	670	640	-21,3	-2,3	-7,4
9	670	690	700	-2,3	-0,1	2,0
12	680	700	660	-0,9	1,3	-3,8
15	710	950	790	2,8	38,5	15,2
18	640	750	740	-6,7	9,3	7,1
21	680	730	770	-1,6	5,7	11,5
24	510	670	720	-25,7	-2,3	5,0

Увеличение зависимости ОДКС тканей среднего и верхнего ярусов растений от температуры объясняется удалённостью от корневой системы и развитой листовой поверхностью этих частей растений, активно испаряющих влагу. Подтверждением этого вывода служит высокая отрицательная кор- реляция между ОДКС верхнего яруса растений и относительной влажностью воздуха, составившая r = -0,82. При этом корреляция между ОДКС тканей нижнего яруса и относительной влажностью воздуха из-за близкого расположения подающей воду корневой системы составила всего r = -0,33.

Среднее значение ОДКС у сорта Лира по результатам суточного определения составило 686 кПа. Этот уровень оказался ниже критических значений ОДКС для возбудителя пепельной гнили (930 кПа) и в целом не провоцировал массовое формирование микро-склероциев. Только на фоне максимальных значений дневной температуры, составившей в послеобеденный период (15-16 ч) в этот день 33,6 °С, ОДКС тканей среднего яруса растений незначительно превысило критические значения ОДКС гриба и составило 950 кПа. Однако уже к 18 ч этот показатель опять вернулся на докритические уровни.

Наиболее стабильно близкий к среднему (≈ 700 кПа) уровень ОДКС у сорта Лира поддерживали ткани нижнего яруса растений в период с 9 ч утра до 21 ч вечера, а также ткани среднего и верхнего ярусов – в ночные и утренние часы (рис. 4).

Рисунок 4 – Суточный ритм осмотического давления клеточного сока (ОДКС) растений сои раннеспелого сорта Лира в фазе налива семян, кПа

Аналогичные исследования суточного ритма ОДКС были проведены на растениях среднеспелого сорта Парма. Растения этого сорта завершали рост и находились на стадии бобообразования. Как и у сорта Лира, минимальные значения ОДКС тканей растений сорта Парма на уровне 500–570 кПа были от- мечены в ночные часы. Максимальные значения ОДКС тканей (810-860 кПа) фиксировали в период с 15 до 21 ч (табл. 2).

Среднеспелый сорт Парма относится к сортам интенсивного типа и в оптимальных по влагообеспечению условиях формирует очень высокие урожаи семян. В то же время этот сорт сильно снижает свою продуктивность в засушливых условиях, сильно поражаясь пепельной гнилью. Дополнительным показателем слабой засухоустойчивости и повышенной зависимости ОДКС растений от влагообеспеченности служит более высокая, чем у сорта Лира, отрицательная корреляция между ОДКС тканей нижнего яруса и относительной влажностью воздуха, даже в непосредственной близости корневой системы составившая r = -0,58.

Таблица 2

Рисунок 5 – Суточный ритм ОДКС растений сои среднеспелого сорта Парма в фазе бобообразования, кПа

Суточный ритм осмотического давления клеточного сока среднеспелого сорта Парма в фазе бобообразования, кПа

Время измерения ОДКС, ч	ОДКС тканей стебля по ярусам растения			Отклонения ОДКС от среднесуточных значений, %
	нижний	средний	верхний	нижний ярус	средний ярус	верхний ярус
0	540	550	710	-20,9	-19,5	4,0
3	500	570	700	-26,8	-17,3	2,5
6	570	550	670	-17,3	-19,5	-2,6
9	660	670	660	-3,4	-1,9	-3,4
12	660	670	800	-3,4	-2,6	17,1
15	670	810	830	-1,9	18,6	21,5
18	740	780	860	7,6	13,5	25,2
21	640	740	860	-7,0	7,6	25,2
24	540	550	710	-20,9	-19,5	4,0

Среднесуточное значение ОДКС у сорта Парма оказалось очень близким к сорту Лира и составило 683 кПа. Поскольку растения сорта Парма находились на более ранней стадии онтогенеза, то потребности воды на формирование репродуктивных органов у них были ниже по сравнению с сортом Лира. Поэтому даже в самые жаркие послеобеденные часы ОДКС растений не превышала критических для пепельной гнили значений и оставалась на уровне 800-860 кПа.

Временной отрезок стабильного и близкого к среднесуточным значениям ОДКС тканей у сорта Парма оказался короче по сравнению с сортом Лира (рис. 5).

На нижнем ярусе растений близкие к средним значения ОДКС фиксировали в период с 9 до 15 ч, на среднем – с 9 до 12 ч, а на верхнем – только в утренние часы (см. табл. 2 и рис. 5).

Для подтверждения и уточнения полученных в исследованиях 2007 г. результатов оценку ОДКС в тканях наиболее характерных представителей разных типов онтогенетической динамики этого показателя продолжили в 2008–2009 гг. Дополнительно у части сортообразцов оценивали ОДКС в фазе физиологического созревания (табл. 3)

Проведённые в 2008-2009 гг. исследования подтвердили, что ОДКС тканей растений в фазы бутонизации и начала цветения заметно варьировало у разных сортообразцов и в среднем по опыту составляло в 2008 г. около 513 кПа, что, в среднем, ниже на 90 кПа по сравнению с 2007 г. (620 кПа). В 2009 г. этот показатель оказался ещё ниже – всего 468 кПа.

К фазам цветения и формирования бобов (1 декада июля) ОДКС в среднем по опыту увеличилось до 554-626 кПа (при 770 кПа в 2007 г.) при варьировании этого показателя от 430 до 820 кПа.

В период налива семян среднее по опыту ОДКС осталось примерно на том же уровне, что и в предыдущей фазе, составив в 2008 и 2009 гг. 647 и 550 кПа соответственно (990 кПа в 2007 г.)

Однако в период физиологического созревания отмечали большое варьирование частных наблюдений по уровням ОДКС, как между сортами, так и по годам исследований. Так, в 2007 г. в период физиологического со

Таблица 3

Динамика ОДКС в тканях нижнего яруса главных побегов генотипов сои в питомнике экологического сортоиспытания, кПа

ВНИИМК, 2007–2009 гг.

Сортообразец Онтогенетическая фаза на момент определения ОДКС, дата определения бутонизация – начало цветения формирование бобов налив семян физиологическое созревание 14.06. 2007 г. 16.06. 2008 г. 17.06. 2009 г. 4.07. 2007 г. 1.07. 2008 г. 1.07. 2009 г. 25.07. 2007 г. 28.07. 2008 г. 31.07. 2009 г. 30.08 2007 г. 1.09 2008 г. 20.08. 2009 г. Ланцетная 620 520 420 700 590 520 1180 700 550 - - - Свапа 540 440 440 660 490 470 950 870 550 - - - Лира 480 480 440 620 630 480 710 640 570 - - - Магева 630 490 470 890 630 610 980 570 600 - - - Светлая 650 550 460 860 700 620 940 650 490 - - - Касатка 600 480 460 830 620 720 1200 630 660 - - - Белгородская 48 530 480 440 790 590 490 1090 550 490 - - - Белгородская 143 590 610 450 730 650 540 920 650 530 - - 650 Воронежская 31 550 580 470 730 650 430 990 630 600 - - - Брянская Мия 600 580 400 730 620 650 1050 540 610 - - - Брянская 11 550 500 450 890 620 450 1140 740 620 - - - Славия 540 370 540 780 560 660 1060 700 610 - - 780 Амфор 650 460 450 800 660 650 910 670 510 - 1340 490 Изидор 650 470 520 840 590 470 980 520 470 1310 820 590 Альба 600 510 510 660 650 450 950 740 540 - 630 800 Селекта 101 700 - 480 800 - 460 910 - 490 - - 630 Селекта 201 670 530 460 770 680 820 950 730 540 - 910 620 Селекта 301 710 - 440 690 - 480 880 - 600 1320 - 670 Селекта 302 610 570 480 770 600 670 1060 500 540 890 - 740 Парма 680 540 535 690 710 544 1080 580 544 1320 1010 556 Рента 670 600 530 680 620 460 850 640 560 1010 720 710 Вилана 590 510 450 820 650 550 800 690 420 690 740 620 Среднее 609 513 468 758 626 554 989 647 550 1090 881 655 зревания среднее по опыту ОДКС составило 1090 кПа, в 2008 г. – 881 кПа, а в 2009 г. – всего 665 кПа. Очевидно, что такие различия были обусловлены различными запасами влаги в почве и температурами, сложившимися в этот период. Тем не менее, выявленные в 2007 г. ранги и типы ОДКС сохранились и в последующие годы, свидетельствуя о наличии, как минимум, частичной генотипической наследуемости разных уровней ОДКС.

Трёхлетние исследования подтвердили наличие трёх характерных типов динамики изменения ОДКС в онтогенезе, условно названных как типы А , Б и В , а также позволили окончательно сформулировать их основные характеристики.

Тип А характеризуется достижением растениями сои сверхкритических (превышающих установленное критическое ОДКС патогена, вызывающее «физиологическую засуху») значений осмотического давления клеточного сока в тканях в фазы бобообразо-вания и налива семян. Такой тип был обнаружен у сортов ВИР-5923, Трембита, Неполегающая 2, Rouest-213, Stine 1680.

Тип Б характеризуется околокритическими значениям ОДКС растений сои в эти же фазы онтогенеза. Такой тип был у сорта К-521.

Тип В представляют собой сортообразцы, сохраняющие докритические для возбудителя пепельной гнили значения ОДКС вплоть до начала физиологического созревания растений. Это были сорта Вилана, Фора, КСХИ-709, Т-102.

Дополнительно были выделены переходные, промежуточные типы онтогенетической динамики ОДКС в тканях сортов сои (табл. 4).

Так, в наиболее засушливом 2007 г. ОДКС некоторых сортов в фазы бобообразования и налива семян немного превышало уровень 930 кПа, в наиболее благоприятном по увлажнению 2009 г. имело значения несколько ниже этого критического уровня. Такие сорта были отнесены к промежуточному типу АБ .

ОДКС ещё одной группы сортов в период бобообразования и налива семян варьировало в пределах 650-690 кПа. Группа таких сортов была отнесена к промежуточному типу БВ .

Полученные в течение трёх лет данные позволили нам окончательно обосновать основной принцип отбора исходного материала для селекции сои на устойчивость к возбудителю пепельной гнили.

Этот принцип заключается в том, что в критические по влагообеспечению фазы бо-бообразования и налива семян выделяют формы растений с осмотическим давлением клеточного сока до 930 кПа. ОДКС не должен превышать этот предел (930 кПа), являющийся критическим для возбудителя пепельной гнили и приводящий к массовому формированию микросклероциев этого гриба, закупоривающих проводящую сосудистую систему растений сои [2].

Таблица 4

Осмотическое давление клеточного сока тканей некоторых сортов сои в онтогенезе

ВНИИМК, с реднее за 2007-2009 гг.

Сорт	Тип онтоге-нети-ческой динамики ОДКС*	ОДКС в основные фазы развития растений, кПа
		1-й настоящий лист	пол ное цветение	бобо-обра-зова-ние	налив семян	физиологическое созревание
Амфор	А	560	760	1170	1100	700
Армавирская 2		530	740	1220	1090	660
Славия	АБ	490	660	870	930	590
Изидор		510	690	820	920	620
Вилана	Б	540	650	800	830	540
Рента		510	600	820	860	520
Альба	БВ	420	510	650	670	430
Валента	В	380	460	650	630	400
Белгородская 6		450	410	650	600	420

*– тип динамики ОДКС устанавливается в критические по влагообеспеченности периоды плодо-образования и налива семян

Выводы. Проведённые исследования суточного ритма ОДКС растений у сортов сои раннеспелой и среднеспелой группы позволили подтвердить предположение о влиянии температуры окружающей среды на концентрацию клеточного сока. Кроме этого, на основании оценок ОДКС двух генетически отдалённых сортов было установлено, что наиболее надёжной является оценка ОДКС в любой части растений в утренние часы или только нижнего яруса растений, но в течение всей первой половины дня.

На основе исследований суточного ритма и онтогенетической динамики ОДКС разработан метод отбора толерантного к болезни исходного материала для селекции сои. Метод предусматривает выделение форм растений с осмотическим давлением клеточного сока, не превышающим 930 кПа в критические по водопотреблению фазы бобообразо-вания и налива семян.

ISSN 0202-5493. МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып.2 (148-149), 2011