Радиостимуляция низкими дозами γ-излучения повышает эффективность аккумуляции, смягчает стресс от избытка меди у водного растения-фиторемедиатора ряски малой (Lemna minor L.)

Медь – тяжелый металл, встречается в пресноводных водоемах в виде простого вещества и ионов Cu+ и Сu2+ (Varma, Misra, 2018). К источникам загрязнения медью относят добычу руды, отходы металлургических предприятий, промышленность, очистные сооружения, поверхностный сток (от транспорта, зданий и атмосферных осадков), сельское хозяйство и естественные процессы (Izydorczyk et al., 2021; Comber et al., 2022). Вследствие распространенности и опасности загрязнения гидросферы Cu2+ важно разработать недорогие, осуществимые и устойчивые технологии очистки сточных вод (Liu et al., 2023). Технологии удаления меди включают физико-химические методы, а также биологические методы, к которым относят биосорбцию, биоаккумуляцию и биоминерализацию, а также фиторемедиацию (Liu et al., 2023). Фиторемедиация – это эффективная технология очистки окружающей среды от различных органических и неорганических загрязнителей c использованием растений и связанных с ними микробов (Pilon-Smits, 2005). Одними из наиболее распространенных видов-фиторемедиаторов пресных водоемов являются растения семейства рясковые. Ряска малая – эврибионт, встречается повсеместно в пресноводных водоемах северного полушария (Bog et al., 2020). Ряска малая используется в токсикологических исследованиях, для фиторемедиации природных и сточных вод благодаря высокой репродуктивной скорости и способности поглощать различные металлы (Elmacı et al., 2009; Üçüncü et al., 2013). Ряска подходит для фиторемедиации водных экосистем, загрязненных Cu2+, благодаря высоким показателям биоаккумуляции металла, простоте и дешевизне культивирования. Ряска является умеренным аккумулятором меди с высоким процентом (≥ 90 %) удаления из промышленных и муниципальных стоков (Bokhari et al., 2016). Однако, согласно Üçüncü et al. (2013), при фиторемедиации эффективность очистки вод может снижаться из-за высокой токсичности Cu2+ для ряски. Повышение аккумулирования и устойчивости растений к Cu2+ способствовало бы более эффективному удалению ионов из загрязненных вод.

Результаты экспериментов по комбинированному действию на ряску малую гамма-излучения в средних и больших дозах и Cu2+ показали, что накопление Cu2+ у предвари- тельно облученных растений усиливается, но после облучения в больших дозах происходит угнетение темпов роста популяции (Bodnar, Cheban, 2022). Гамма-излучение относится к коротковолновым электромагнитным излучениям, которое возникает при радиоактивном распаде определенных элементов и обладает высокой проникающей способностью. Радиация оказывает влияние на морфологические, физиологические, биохимические, генетические и цитологические свойства клеток и тканей, а эффекты зависят от дозы и интенсивности воздействия (Kiani et al., 2022). Повышение толерантности растений к абиотическому стрессу возможно добиться посредством низких доз гамма-излучения (Zhang et al., 2016). Стимулирование стрессоустойчивости посредством малых доз радиации называется радиостимуляцией или радиопраймингом (Villegas et al., 2025). Радиостимуляция малыми дозами используется для повышения урожайности сельскохозяйственных растений, при этом усиливается скорость прорастания семян, ферментативная активность, усвоение питательных веществ, деление и рост клеток, что способствует стойкости к абиотическим и биотическим факторам (Katiyar et al., 2022).

Если для сельскохозяйственных культур важно получить в результате радиостимуляции улучшенную всхожесть семян и повышение урожайности культуры, то для растений-фиторемедиаторов необходимо, чтобы они накапливали большее количество металлов без ущерба для таких важных параметров, как скорость роста и биомасса. Предполагаем, что облучение ряски малыми дозами радиации будет способствовать лучшему накоплению металла, не оказывая негативного влияния на рост и развитие растений. Целью данной работы было изучение реакции растений ряски малой на действие гамма-излучения в малых дозах и избыток Cu2+. Возможность использования ионизирующего излучения для повышения эффективности фиторемедиации загрязненных вод не изучена, но есть работы, в которых показано, что низкие дозы повышают устойчивость растений к тяжелым металлам (Wang et al., 2017). Изучение изменения поглощения тяжелых металлов после облучения имеет фундаментальное значение для токсикологии растений, радиоэкологии, на практике может применяться для фиторемедиации загрязненных водоемов, а также для фитодобычи.

Материалы

В работе использовали ряску малую ( Lemna minor L.) из лабораторной культуры Института биологии Коми НЦ УрО РАН. Растения выращивали на среде Штейнберга (Steinberg, 1946) в климатической камере Binder с контролем температуры (24 ± 0.1 °С) и режима освещения (16 часов день / 8 часов ночь) (OECD, 2006).

Методы

Условия эксперимента

Для эксперимента растения облучили в дозе 7 Гр на установке гамма-излучения с источником Cs¹³⁷ («Исследователь», Россия) с мощностью дозы 0.74 Гр/ мин. После облучения ряску промыли в дистиллированной воде и перенесли по 12 растений в стеклянные емкости с питательной средой, содержащей Cu²⁺ (3, 5 или 6 мкмоль/л) в виде CuCl₂. Эксперимент проводили в трех независимых повторностях (по 5 емкостей на вариант в каждой). В качестве контроля использовали растения без воздействия, выращенные на среде Штейнберга. На среде с Cu²⁺ растения культивировали в течение 7 дней. Рассматриваемые концентрации Cu²⁺ соответствуют реальному загрязнению водных объектов и приводят к угнетению роста ряски малой (Боднарь и др., 2018). У растений определяли удельную скорость роста, среднюю площадь фрондов, долю фрондов с повреждениями. Удельную скорость роста рассчитывали как отношение разности натуральных логарифмов числа фрондов в последние и первые сутки ко времени (OECD, 2006). Повреждение фрондов рассматривали как отношение фрондов с повреждениями (хлорозы, некрозы) к общему числу фрондов. Среднюю площадь фрондов рассчитывали по фотографиям с использованием программы Jmage J ( NIH , USA).

Анализ содержания Cu2+ в растениях определяли методом атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной плазмой. Для разложения растительных образцов (каждый по 500 мг) использовалась микроволновая минерализация HNO3 и H2O2. Анализ проводили в Экоаналитической лаборатории Института биологии ФИЦ Коми НЦ УрО РАН. Эксперимент проводили в трех независимых повторностях.

Определение хлорофиллов и каротиноидов

Хлорофиллы и каротиноиды определяли в сырой массе растений через четверо суток после начала эксперимента в спиртовой вытяжке спектрофотометрически при длинах волн 470, 649 и 664 нм, концентрацию рассчитывали по формуле (Lichtenthaler, 1987). Пробоподготовка включала измельчение растительного материала (25 мг) с кварцевым песком и карбонатом кальция и экстракцию 95 % водным раствором этанола. Эксперимент проводили в трех независимых повторностях (по 5 образцов свежей растительной ткани в каждой).

Определение малонового диальдегида (МДА)

Концентрацию МДА у растений определяли через четверо суток после начала эксперимента по методу, основанному на способности МДА реагировать с тиобарбитуровой кислотой в кислой среде при нагревании с образованием окрашенного триметинового комплекса, который можно измерить фотометрически по максимуму поглощения при 532 нм (Молекулярно-генетические и биохимические методы…, 2012). Навеску свежей растительной ткани (50 мг) высушивали при комнатной температуре, затем перетирали с кварцевым песком и добавляли 1.5 мл 20 % трихлоруксусной кислоты, далее центрифугировали в течение 15 мин при 10000 об./ мин. После отбирали 0.3 мл супернатанта и добавляли 1.2 мл 0.5 % тиобарбитуровой кислоты в 20 % трихлоруксусной кислоте, нагревали при 95 °C в течение 30 мин, центрифугировали. Эксперимент повторяли три раза (по пять образцов на каждый вариант).

Статистическая обработка данных

Для анализа накопления Cu²⁺ рассчитывали коэффициент биоконцентрации (КБК), соотношение между содержанием элемента в сырой массе растений и начальным содержанием в среде (Vidakovic-Cifrec et al., 2015). Экспериментальные и контрольные группы сравнивали с использованием критериев Стьюдента и Манна – Уитни. Для оценки связи использовали коэффициент корреляции Пирсона ( r ). Статистический анализ выполнен с использованием программного пакета Statistica 6.0 (StatSoft, 2001).

Результаты

Облучение в малых дозах не привело к изменению темпов роста лабораторной культуры ряски малой, скорость роста не от- личалась от контрольной (p ≤ 0.05, критерий Стьюдента). Воздействие Cu2+ в концентрациях 3, 5, 6 мкмоль/л способствовало дозозависимому снижению удельной скорости ряски на 30, 43 и 55 % соответственно. Сравнение темпов роста показало, что скорость роста облученных и необлученных растений за 7 дней роста на среде с 3, 5, 6 мкмоль/л Cu2+ одинакова (p < 0.05, критерий Стьюдента).

Облученные растения были насыщенно зеленого цвета, уровень повреждений ряски после 7 Гр не отличался от контрольного и составлял ≤ 2 %. Cu²⁺ в рассматриваемых концентрациях приводила к росту доли повреждений фрондов в популяции (табл. 1). После однократного воздействия гамма-излучения снизился уровень повреждений фрондов у растений, которые выросли на среде с избытком Cu²⁺ ( p ≤ 0.05, критерий

Манна – Уитни). Значимый эффект радиостимуляции наблюдали при низкой концентрации Cu2+ (3 мкмоль/л). Уровень повреждений после облучения снизился на 24 % по сравнению с необлученными растениями. Популяции растений после 7 дней культивирования растений на 3 мкмоль/л Cu2+ отличались по цвету: ряска без облучения стала желто-зеленой, у облученных растений – светло-зеленой. У облученных растений уровень повреждений при действии 6 мкмоль/л Cu2+ снизился на 10 %, а при 5 мкмоль/л – на 14.5 % относительно необлученных растений.

Площадь фрондов после облучения в дозе 7 Гр соответствовала контрольным растениям ( p < 0.05, критерий Стьюдента). У облученных и необлученных растений после недели воздействия Cu²⁺ площадь изменялась одинаково ( р ≤ 0.05).

Таблица 1. Сравнение основных параметров роста у ряски малой

Cu2+, мкмоль/л	Удельная скорость роста, сутки-1		Повреждения фрондов, %		Площадь фрондов (S d/S )
	Без облучения	С облучением	Без облучения	С облучением	Без облучения	С облучением
0	0.3±0.004	0.29±0.003	0.56±0.14	0.55±0.15	0.97±0.023	0.93±0.18
3	0.21±0.005	0.209±0.003	27.5±1.5	20.8±1.3*	0.56±0.025	0.61±0.01
5	0.172±0.006	0.176±0.002	77.2±1.3	63.5±1.9*	0.52±0.019	0.52±0.09
6	0.159±0.003	0.157±0.005	100	79.4±1.7*	0.61±0.026	0.55±0.015

Примечание. * - отличия достоверны по сравнению с необлученными растениями, p < 0.01, критерий Стьюдента.

Концентрация хлорофиллов снизилась после воздействия Cu2+ (табл. 2). Радиостимуляцией удалось повысить уровень хлорофиллов у растений, растущих на избытке Cu2+. У растений после радиостимуляции повысилось содержание хлорофилла a, суммы хлорофиллов a + b в сравнении с необлучен-ными растениями в варианте с 3 мкмоль/л

Cu2+ на 14.5 и 17.2 % соответственно. Во всех остальных вариантах с избытком Cu2+ содержание хлорофиллов у облученных и необлу-ченных растений одинаково (р < 0.05, критерий Стьюдента). Содержание каротиноидов снизилось при воздействии Cu2+ и совпадало у облученных и необлученных растений (p ≤ 0.05, критерий Стьюдента).

Таблица 2. Содержание хлорофиллов и каротиноидов

Cu2+, мкмоль/л	Хлорофилл а , мг/г сырого веса	Хлорофилл b , мг/г сырого веса		Хлорофилл а + b , мг/г сырого веса		Каротиноиды, мг/г сырого веса
	Без облу- С облуче-чения    нием	Без облучения	С облуче нием	Без облучения	С облуче нием	Без облу чения	С облуче нием
0	0.85±0.02 0.89±0.02	0.33±0.03	0.39±0.02	1.16±0.04	1.28±0.04	0.22±0.01	0.20±0.01
3	0.62±0.04 0.71±0.02*	0.31±0.02	0.35±0.02	0.93±0.05	1.09±0.04*	0.16±0.01	0.17±0.00
5	0.57±0.05 0.58±0.02	0.32±0.04	0.32±0.01	0.89±0.09	0.93±0.02	0.15±0.01	0.16±0.01
6	0.53±0.03 0.58±0.02	0.29±0.02	0.34±0.02	0.81±0.05	0.91±0.03	0.15±0.01	0.16±0.01

Примечание. * - отличия достоверны по сравнению с необлученными растениями, p < 0.01, критерий Стьюдента.

При действии Cu2+ повышалось содержание МДА, который является продуктом перекисного окисления липидов клеточных мембран, вследствие развития окислительного стресса (табл. 3). После облучения в дозе 7 Гр содержание МДА у растений соответство- вало контрольному уровню. Катионы Cu2+ способствовали повышению уровня МДА (p < 0.05). Стимуляция растений малыми дозами не привела к снижению уровня МДА у ряски после воздействия Cu2+.

Таблица 3. Концентрация малонового диальдегида (МДА)

Cu2+, мкмоль/л	МДА, нмоль/г сырой массы
	Без облучения	С облучением
0	9.4±1.4	10.1±1.8
3	19.5±1.1	18.7±1.5
5	47.7±1.6	45.56±1.7
6	56.75±1.6	52.4±1.7

Радиостимуляция способствовала большему накоплению Cu2+ в растениях по сравнению с растениями без облучения (табл. 4). Наиболее эффективно накапливали Cu2+ облученные растения при 6 мкмоль/л Cu2+, наименее – при 3 мкмоль/л. Коэффициент биоконцентрации (КБК) Cu2+ увеличился у облученных растений на 16.8 % (с 208 до 243) после культивирования при 6 мкмоль/л Cu2+, при концентрации меди 3 мкмоль/л Cu2+ – на 19.4 % (с 134 до 160).

Таблица 4. Содержание Cu2+ в растениях

Cu2+ в среде, мкмоль/л	Содержание Cu2+ в растениях, мг/кг сырой массы (коэффициент биоконцентрации)
	Без облучения	С облучением
3 (0.201 мг/л)	26.8±1 (134)	32±1.8 (160)*
5 (0.32 мг/л)	66.25±9.2 (207)	66.3±5 (207.2)
6 (0.403 мг/л)	84±4.1 (208)	98±5.9 (243)

Примечание. * - отличия достоверны по сравнению с необлученными растениями, p < 0.05, критерий Манна – Уитни.

Обсуждение

Повышение эффективности фиторемедиации загрязненных тяжелыми металлами водоемов с помощью ряски малой является актуальным направлением в биотехнологии и водной экотоксикологии. При использовании ряски в очистке сточных вод есть ограничения. Высокое накопление Cu2+ в биомассе вызывает токсичность, что внешне проявляется пожелтением фрондов (хлорозами) и приводит к снижению эффективности удаления Cu2+ (Al-Baldawi et al., 2022). Как было уже показано ранее (Боднарь и др., 2018) и подтверждено в данной работе, воздействие Cu2+ (3-6 мкмоль/л) привело к снижению удельной скорость роста популяции ряски, повышению уровня повреждений в виде хлорозов и/или некрозов фрондов в сравнении с контрольными растениями без обработки, уменьшению средней площади фрондов. Медь относится к тяжелым металлам, но в физиологических количествах является необходимым для роста и развития растений элементом, т. к. входит в состав пластоцианина и цитохромоксидазы, ключевых белков для фотосинтеза и дыхания, необходимых для усвоения углерода и генерации АТФ (Singh et al., 2020; Raj et al., 2020; Singh et al., 2022). Ионы Cu2+ при избыточном поступлении оказывают отрицательное воздействие на растения, приводят к снижению роста, всхожести и прорастания семян, уменьшению размеров листьев, хлорозам, подавляют фотосинтез и провоцируют развитие окислительного стресса у растений (Mir et al., 2021). В загрязненных средах Cu2+ может вызывать нарушение поступления питательных веществ, физиологические, морфологические и биохимические изменения (Adrees et al., 2015). Ионы Cu2+ воздействуют на фотосистему II (ФСII), снижают содержание фотосинтетических пигментов и разрушают тилакоидные мембраны (Miras-Moreno et al., 2022).

Для улучшения эффективности аккумулирования и одновременно повышения устойчивости растений к Cu2+ использовали однократное облучение в дозе 7 Гр. Низкие дозы гамма-излучения оказывают стимулирующее действие на растения, в отличие от высоких доз, вызывающих ингибирование роста (Villegas et al., 2023). Анализ зависимости доза – эффект показал, что угнетение скорости роста начинается от 11–18 Гр, поэтому 7 Гр можно отнести к малым дозам для ряски (Боднарь и др., 2016). В данном исследовании это подтвердилось, т. к. облучение в дозе 7 Гр не вызвало изменения скорости роста, снижения площади фрондов, отличного от контроля увеличения частоты появления некрозов и хлорозов (р ≤ 0.05).

Предоблучение растений в дозе 7 Гр перед воздействием не способствовало повышению токсичности Cu2+ для ряски. Радиостимуляция, основанная на концепции гормезиса, предполагает, что низкие дозы стрессора вызывают полезные адаптивные реакции, повышая устойчивость растений к последующим, более интенсивным стрессорам (Villegas et al., 2023). В качестве положительного эффекта воздействия радиации в данном эксперименте можно рассматривать снижение повреждений фрондов от воздействия Cu2+ на 10–24 %, поэтому облучение в дозе 7 Гр можно считать стимулирующим. У растений явление радиационного гормезиса проявляется в виде усиления роста, ускоренного развития, повышения устойчивости к стрессорам или накопления интересующих соединений в ответ на облучение в низких дозах (Volkova et al., 2022). Воздействие радиации в малых дозах вызывает множественные модификации физиологических и биохимических процессов в растениях, например антиоксидантной ферментативной активности, веществ осмотической регуляции, сигнальных путей передачи и вторичных метаболитов, которые помогают растениям быстрее и эффективнее реагировать на повторяющийся стресс или передавать эту возможную защитную меру следующему поколению (Li et al., 2018; Zhang et al., 2023).

Увеличение уровня повреждений фрон-дов при воздействии Cu2+ связано со снижением содержания хлорофиллов (r = –0.9, p ≤ 0.005). Ингибирующее воздействие на рост вызвано влиянием Cu2+ на процесс фотосинтеза, а именно снижением транспорта электронов к фотосистеме I, при этом большая часть поглощенной энергии рассеивается в виде тепла из-за увеличения количества неактивных реакционных центров (Sigh et al., 2022). Предоблучение способствовало снижению уровня повреждений фрондов при 3 мкмоль/л Cu2+, что согласуется с результатами по увеличению содержания хлорофиллов a + b. На ряске малой было показано, что низкие дозы хронического γ-облучения (27– 1500 мГр/ч) повышают экспрессию генов, отвечающих за усиление фотосинтеза у Lemna minor (Van Hoeck et al., 2017).

Ряска малая способна аккумулировать Cu2+ из водной среды, что подтверждено исследованиями, проводимыми в естественных условиях (Panfili et al., 2017). Благодаря способности к аккумуляции, быстрому росту, неприхотливости к условиям данный вид используется в фиторемедиации природных и сточных вод с высоким содержанием Cu2+ (Konakci, 2024). Для повышения аккумулирования меди и смягчения фитотоксического действия меди экспериментально исследованы различные варианты предварительной обработки растений, в т. ч. физические факторы, например воздействие электромагнитного излучения, а также биопрепараты (Арефьева и др., 2021; Miras-Morena et al., 2022). В данной работе анализ накопления Cu2+ в сырой массе растений показал, что после облучения имеется тенденция к повышению эффективности биоаккумуляции Cu2+ при сохранении ростовых характеристик популяции. Большему накоплению Cu2+ растений после радиостимуляции может способствовать снижение доли фрондов с хлорозами или некрозами. Эффективность накопления Cu2+ ряской повысилась на 19.4 % при 3 мкмоль/л Cu2+, на 16.7 % – при 6 мкмоль/л Cu2+.

Заключение

Облучение в малых дозах (7 Гр) не ухудшило характеристик роста популяции ряски, более того, можно отметить такие признаки смягчения фитостресса от избытка Cu2+ у растений, как снижение доли растений с поврежденными фрондами. Радиостимуляция способствовала увеличению накопления Cu2+ в растениях, выращенных на среде с избытком Cu2+. Использование при фиторемедиации облученной в малых дозах ряски малой можно рекомендовать для повышения эффективности очищения загрязненных Cu2+ сточных и природных вод.