Влияние Т-2 токсина и зеараленона на содержание провоспалительных цитокинов в первичных культурах клеток печени

Введение. Микотоксины представляют собой опасные метаболиты грибов, которые содержатся в кормах и пищевых продуктах [1, 2]. Несколько классов этих соединений могут продуцироваться одним видом грибов. Особенно опасны в этом отношении виды из рода Fusarium [3–6]. Они могут производить трихоте-цены и зеараленон, которые признаны важными загрязнителями пищевых продуктов и кормов. Эти классы вызывают широкий спектр токсикологических эффектов, главным образом из-за разнообразия их химической структуры [7, 8].

В зараженных зерновых культурах часто обнаруживаются комбинации нескольких микотоксинов Fusarium [9, 10], представляющих угрозу для здоровья человека и животных [11]. Растет обеспокоенность по поводу опасности воздей- ствия смесей этих микотоксинов в пищевых продуктах из-за их естественного совместного присутствия [12, 13].

Зеараленон – нестероидный эстрогенный микотоксин, выделенный из нескольких разновидностей грибов Fusarium . Исследования на различных видах животных (например, на грызунах, свиньях и обезьянах) показали, что зеа-раленон и его метаболиты проявляют эстрогенную и анаболическую активность [22]. Кроме того, токсины Fusarium вызывают перекисное окисление липидов, ингибируют синтез белков и ДНК и вызывают гибель клеток [23].

Куры относительно толерантны к трихотеце-нам по сравнению с млекопитающими, однако присутствие токсина Т-2 в кормах служит актуальной проблемой в птицеводстве во всем мире [24–26]. Поскольку печень играет решающую роль в процессах детоксикации и является одной из основных мишеней трихотеценов, она особенно подвержена вредному воздействию токсина Т-2 [27, 28].

Цель исследования – изучить влияние Т-2 токсина и зеараленона на продукцию провоспа-лительных цитокинов интрелейкина-6 (ИЛ-6) и интерлейкина-8 (ИЛ-8).

Объекты и методы. Выделение гепатоцитов проводили, по аналогии с работами [29, 30], из трехнедельных цыплят-бройлеров-самцов КОББ 500, полученных от компании ООО «Челны-Бройлер». После обезглавливания животного в СО 2 камере печень промывали и обескровливали. Сначала печень перфузировали 150 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS), содержащего 0,5 ммоль/л этиленгликоля тетрауксусной кислоты (EGTA). После этого печень промывали 150 мл EGTA-HBSS, затем 100 мл MgCl 2 и CaCl 2 (оба 7 ммоль/л). После иссечения и мягкого встряхивания щипцами печень помещали на 45 мин в ледяной раствор бычьего сывороточного альбумина 25 мг/мл (БСА).

Фракции, обогащенные гепатоцитами, выделяли с помощью многоступенчатого дифференциального центрифугирования. Сначала клеточные суспензии трижды центрифугировали на низкой скорости (100× g ) в течение 3 мин в среде Вильямса, с добавлением 0,22 % NaHCO 3 , 50 мг/мл гентамицина, 2 мм глютамина, 4 мкг/л дексаметазона, 20 МЕ/л инсулина и 5 % фетальной бычьей сыворотки (FBS). После трехкратной ресуспендации была получена очищенная фракция гепатоцитов.

Клеточную суспензию разливали в стеклянные флаконы из химически инертного стекла объемом 2 см3 каждый. Спиртовой раствор Т-2 токсина и зеараленона вносили во флаконы в количестве 0,001 см3. Контролем служили флаконы с клеточной суспензией – вносили этиловый спирт (96 об %) 0,001 см3. Дозы Т-2 токсина и зеараленона составили 0; 10; 100 и 1000 нМ/м3, по аналогии с работами [31]. Токсины были получены по аналогии с работой [25]. В последующем выдерживали флаконы с культурой в инкубаторе при температуре плюс 37 °С. Длительность инкубирования составила 12 ч и 24 ч. Затем клетки с помощью смеси растворов трипсина и версена подвергали диспергированию. Диспе-ригирующий раствор вносили в объеме 0,2 см3 на флакон и инкубировали в термостате при температуре плюс 37 °С. Период инкубации составил 20 мин. Для остановки действия диспери-гирующей смеси вливали 1 см3 питательной среды, содержащей бычью сыворотку крови. Продукцию провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-8 изучали методом ИФА наборами производства «Вектор». Относительные концентрации цитокинов (пг/л) перерассчитывали, учитывая среднее значение монокультур гепатоцитов в отрицательном контроле, равном 1. Для стандартизации значений, полученных с помощью ранее упомянутого метода, определяли общую концентрацию белка клеточных лизатов.

Обработку результатов производили методом вариационной статистики (критерий достоверности Стьюдента). Разница между сравниваемыми значениями воспринималась достоверной при Р ≤ 0,05.

Результаты и их обсуждение. Результаты исследования содержания ИЛ-6 и ИЛ-8 в клеточной суспензии при внесении Т-2 токсина представлены в таблице 1.

Таблица 1

Содержание ИЛ-6 и ИЛ-8 в клеточной суспензии при внесении Т-2 токсина (M±m, n = 10)

Вносимое вещество	Концентрация, нМ/дм3	ИЛ-6		ИЛ-8
		Длительность		инкубации, ч
		12	24	12	24
Контроль	0	1,0±0,03	1,0±0,03	1,0±0,02	1,0±0,03
Т-2 токсин	10	1,08±0,03	1,35±0,05*	0,84±0,03	1,22±0,04
Т-2 токсин	100	1,48±0,05*	1,42±0,05*	0,92±0,03	1,35±0,04*
Т-2 токсин	1000	1,64±0,05*	1,27±0,05*	0,83±0,03	1,48±0,05*

Здесь и далее : * Р ≤ 0,05.

Как следует из данных, представленных в таблице 1, концентрация ИЛ-6 отличалась в клеточной суспензии при внесении в культуру 100,0 и 1000,0 нмоль/дм3 Т-2 токсина после 12 ч инкубации: так, она достоверно увеличивалась относительно контрольных данных на 48 и 64 % соответственно. При этом внесение Т-2 токсина в концентрации 10,0 нмоль/дм3 не приводило к статистически значимому изменению концентрации ИЛ-6. Увеличение времени инкубации до 24 ч приводило к тому, что в культурах, куда вносили самую низкую дозу токсина, происходило усиление продукции ИЛ-6 до 35 % сверх контроля, однако при двух других концентра- циях наблюдалась тенденция к уменьшению содержания провоспалительного цитокина от величин, накопленных при 12 ч инкубации.

Концентрация ИЛ-8 отличалась в клеточной суспензии при внесении в культуру Т-2 токсина после 12 ч инкубации: так, она уменьшалась относительно контрольных данных от 17 до 8 % соответственно. Увеличение времени инкубации до 24 ч приводило к тому, что в культурах происходила активация синтеза ИЛ-8 до 48 % выше контроля.

Результаты исследования содержания ИЛ-6 и ИЛ-8 в клеточной суспензии при внесении зеараленона представлены в таблице 2.

Таблица 2

Содержание ИЛ-6 и ИЛ-8 в клеточной суспензии при внесении зеараленона (M±m, n = 10)

Вносимое вещество	Концентрация, нМ/дм3	ИЛ-6		ИЛ-8
		Длительность инкубации, ч
		12	24	12	24
Контроль	0	1,0±0,03	1,0±0,03	1,0±0,03	1,0±0,03
Зеараленон	10	1,05±0,03	1,09±0,04	0,92±0,03	1,02±0,04
Зеараленон	100	1,07±0,03	1,16±0,05	0,97±0,03	1,05±0,04
Зеараленон	1000	1,24±0,04*	1,07±0,04	0,88±0,03	1,24±0,05*

Как следует из данных, представленных в таблице 2, концентрация ИЛ-6 незначительно отличалась в клеточной суспензии относительно контроля при внесении в культуру 10,0 и 100,0 нмоль/дм3 зеараленона после 12 ч инкубации и она увеличивалась от 5 до 7 %, что находится в пределах статистической погрешности. Достоверно увеличивалась концентрация ИЛ-6, относительно контрольных данных, на 24 % при внесении зеараленона в концентрации 1000,0 нмоль/дм3, что все равно меньше, чем при внесении Т-2 токсина. Увеличение времени инкубации до 24 ч приводило к тому, что в культурах, куда вносили самую низкую дозу токсина, происходило незначительное усиление продукции ИЛ-6 – от 9 до 16 % сверх контроля, однако изменения носили статистически недостоверный характер. При максимальной концентрации токсина наблюдалась тенденция к уменьшению содержания провоспалительного цитокина от величин, накопленных при 12 ч инкубации.

Концентрация ИЛ-8 статистически не отличалась в клеточной суспензии при внесении в культуру зеараленона после 12 ч инкубации от- носительно контроля. Увеличение времени инкубации до 24 ч приводило к тому, что в культурах происходила активация синтеза ИЛ-8 при максимальном внесении токсина до 24 % выше

Результаты исследования содержания ИЛ-6 и ИЛ-8 в клеточной суспензии при комбинированном внесении Т-2 токсина и зеараленона представлены в таблице 3.

контроля.

Содержание ИЛ-6 и ИЛ-8 в клеточной суспензии при комбинированном внесении Т-2 токсина и зеараленона (M±m, n = 10)

Таблица 3

Вносимое вещество	Концентрация, нМ/дм3	ИЛ-6		ИЛ-8
		Длительность инкубации, ч
		12	24	12	24
Контроль	0	1,0±0,03	1,0±0,03	1,0±0,02	1,0±0,03
Т-2 токсин + зеараленон	10	1,09±0,03	1,30±0,05*	0,89±0,03	1,28±0,04
Т-2 токсин + зеараленон	100	1,43±0,05*	1,35±0,05*	0,96±0,03	1,45±0,04*
Т-2 токсин + зеараленон	1000	1,69±0,05*	1,29±0,05*	0,85±0,03	1,62±0,05*

Как следует из данных, представленных в таблице 3, динамика концентрации ИЛ-6 имела те же тенденции, что и у Т-2 токсина, внесение зеараленона не изменяло профиль динамики содержания. В клеточной суспензии при внесении в культуру 100,0 и 1000,0 нмоль/дм3 Т-2 токсина после 12 ч инкубации достоверно увеличивалась относительно контрольных данных на 43 и 69 % соответственно. При этом внесение обоих микотоксинов в концентрации 10,0 нмоль/дм3 не приводило к статистически значимому изменению концентрации ИЛ-6. Увеличение времени инкубации до 24 ч приводило к тому, что в культурах, куда вносили самую низкую дозу токсинов, происходило усиление продукции ИЛ-6 до 30 % сверх контроля, однако при двух других концентрациях наблюдалась тенденция к уменьшению содержания провоспалительного цитокина от величин, накопленных при 12 ч инкубации.

Динамика концентрации ИЛ-8 имела те же тенденции, что и у Т-2 токсина, внесение зеара-ленона не изменяло профиль динамики содержания. После 12 ч инкубации она уменьшалась относительно контрольных данных от 15 до 4 %. Увеличение времени инкубации до 24 ч привело к тому, что внесение двух токсинов увеличивало содержание ИЛ-8 по сравнению с моновнесением – в культурах происходила активация синтеза ИЛ-8 до 62 % выше контроля.

Заключение. Таким образом, концентрация провоспалительного цитокина ИЛ-6 была повышена в результате воздействия Т-2 микотокси- ном как 100,0 нмоль/дм3, так и 1000,0 нмоль/дм3 в культуре гепатоцитов, после 12 ч инкубации в результате быстрой токсинной атаки, но не при концентрации токсина 10,0 нмоль/дм3. Однако в модели клеточной культуры, при воздействии Т-2 токсином в течение 24 ч, что соответствует более длительному воздействию токсина, сопровождающемуся адаптационным ответом, достоверных различий обнаружено не было. В концентрации ИЛ-8 достоверные различия были обнаружены после 24 ч инкубации по сравнению с контролем. При внесении аналогичных концентраций зеараленона значительных изменений в концентрации цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-8 не наблюдалось, за исключением случая с максимальной концентрацией токсина. При совместном внесении токсинов динамика содержания ИЛ-6 была сходна с таковой у Т-2 токсина, но потенцирующего эффекта не регистрировали, а содержание ИЛ-8 изменялось сильнее, чем при внесении монотоксина.