Антимикробное действие экстракта граната на стафилококк

Гранат обыкновенный ( Punica granatum L. ) ― известное плодовое дерево, произрастающее в Юго-Западной Азии и на Кавказе. Целебные свойства этого растения также были известны еще в глубокой древности. Так, Авиценна в своём фундаментальном труде «Канон врачебной науки» описывал свойства различных частей граната для лечения расстройств желудочно-кишечного тракта, рвоты, болезней печени, легочных воспалений и других.

Современная наука подтверждает высокую ценность гранатового сока как богатого комплекса биологически активных веществ. В его состав входят неза- менимые аминокислоты, витамины различных групп, минеральные вещества и растительная клетчатка. Механизм действия различных фенольных компонентов, содержащихся в разных частях граната, описан во многих исследованиях. Эти компоненты обладают мощными антибактериальными, антиоксидантными, противовоспалительными, противодиарейными, противодиабетическими, противовирусными свойствами, а также способствуют борьбе с ожирением и защищают от многих других проблем со здоровьем [1].

Кожура плодов граната и чистые компоненты были активны против широкой группы изолятов M. tuberculosis и β-лактамазы, продуцирующих K. Pneumonia . Танины кожуры граната губительно действуют на патологическую флору кишечника (стафилококки, сальмонеллы), не оказывая воздействия на сапрофитные бактерии. Экстракт цветков граната проявляет антибактериальную активность как против грамположительных, так и против грамотрицательных бактерий, вызывающих пищевое отравление [2].

Анализ научной литературы указывает на ключевую роль полифенольных веществ в обеспечении фармакологического действия экстрактов из плодов и кожуры граната [3]. В экстракте кожуры граната содержится большое количество биоактивных фенольных соединений, таких как эллагитаннины, дубильные вещества и антоцианы, в том числе эллаговая кислота, а также пуникалагин (2,3-гексагидроксидифеноилгаллагол-D-глюкоза) [4]. Содержание антоцианинов в гранатовом соке промышленного производства составляет для эллаговой кислоты в среднем 4 мг/100 см3, общая концентрация эллаготанинов (в основном пу-никалина и пуникалагина) ― в среднем 40 мг/100 см³ [5].

Кроме того, пуникалагин обладает противомикробной активностью в отношении некоторых патогенных бактерий, таких как S. aureus, Salmonella и Vibrio parahaemolyticus . Пуникалагин оказывает хорошее бактериостатическое действие на S. aureus при минимальной ингибирующей концентрации (МИК) 0,25 мг/мл [6].

Цель исследования: провести сравнительный анализ минимальной подавляющей концентрации (МПК) трех исследуемых веществ в отношении клинического изолята Staphylococcus aureus , а также определить и сопоставить эффективность каждого из тестируемых веществ в плане подавления роста исследуемого штамма стафилококка. Объекты исследования ― натуральный концентрат сока плодов граната, азитромицин и амоксициллин в сочетании с клавулановой кислотой.

Материалы и методы

В ходе эксперимента применялась методика, регламентированная документом МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». Основной метод исследования — серийные разведения в питательной среде Мюллера ― Хинтона.

Клинический штамм золотистого стафилококка был выделен из биоматериала пациента с хроническим бактерионосительством. Получение чистой культуры Staphylococcus aureus осуществлялось с использованием селективной питательной среды ГРМ №10. Для создания бактериальной суспензии использовался оптический стандарт мутности МакФарланда, обеспечивающий необходимую концентрацию микроорганизмов.

Исследуемый образец с антибактериальным эффектом представлял собой дегидратированный экстракт гранатового сока. Концентрат требуется восстановить путем разведения с водой в соотношении 1:4,5, где 1 ― концентрат, 4,5 ― вода, чтобы получить раствор, эквивалентный натуральному соку. Для контроля и сравнения эффективности использовались рабочие растворы следующих антибиотиков: азитромицина (100 мг/мл) и амоксициллина + клавулановой кислоты (200+40 мг/мл).

Результаты и обсуждение

Для определения антибиотикочувствительности методом серийных разведений был подготовлен ряд пробирок, каждая из которых содержала 0,5 мл иноку-люма золотистого стафилококка в концентрации 106 КОЕ/мл в изотоническом растворе, а также 0,5 мл жидкой питательной среды с различной концентрацией исследуемых антибактериальных препаратов (азитромицин, амоксицил-лин+клавулановая кислота и концентрат граната). Полученные образцы помещались в термостат на 22–24 ч, после чего производился учет подавления роста микрофлоры. В пробирках с высокой концентрацией антибактериального средства наблюдалось подавление роста микрофлоры в виде сохранения прозрачности раствора после суток инкубации. Пробирки с низкой концентрацией антимикробного средства характеризовались помутнением за счет роста патогенной флоры и неэффективности препарата данной концентрации подавить рост стафилококка. Минимальная подавляющая концентрация изучаемого антибактериального средства определялась по пробирке с наименьшей концентрацией противо-микробного препарата, которой было достаточно для сохранения прозрачности среды после инкубации и подавления роста бактерий.

Таблица 1

Определение МПК антибиотиков в отношении стафилококка

Номер пробирки	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Концентрация   анти биотика (мг/л)	128	64	32	16	8	4	2	1	0,5	0,25	0,12	0,06
Подавление роста бактерий в растворе азитромицина	–	–	–	–	–	–	–	–	–	–	–	–
Подавление роста бактерий в растворе амоксициллина с кла-вулановой кислотой	+	+	+	+	+	–	–	–	–	–	–	–

Минимальная подавляющая концентрация для азитромицина и амоксициллина с клавулановой кислотой определялась в диапазоне от 0,06 до 128 мг/л. МПК для амоксициллина с клавулановой кислотой составила 8 мг/л, то есть подавление роста микроорганизмов наблюдалось до 5-й пробирки включительно. С учетом фармакокинетики данный показатель МПК соответствует пероральному приему амоксициллина с клавулановой кислотой в дозировке 500 мг каждые 8 часов.

МПК для азитромицина не была определена в связи с наличием роста микроорганизмов во всех пробирках, из чего следует вывод об антибиотикорезистент- ности выделенного клинического штамма золотистого стафилококка в отношении данного антибиотика.

Таблица 2

Определение МПК гранатового сока в отношении стафилококка

Номер пробирки	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Концентрация гранатового сока (г/л)	1481,6	740,8	370,4	185,2	92,6	46,3	23,2	11,6	5,8	2,9	1,4	0,7
Подавление роста бактерий в растворе гранатового сока	+	+	+	+	+	+	–	–	–	–	–	–

МПК для концентрата гранатового сока определялась в диапазоне его разбавления от 4 до 8 192 раз. Подавление роста бактерий в растворе граната определялось до 6-й пробирки включительно. Следовательно, МПК для концентрата гранатового сока определена в пробе при его разбавлении 128 раз, что соответствует разбавлению гранатового сока в 23,27 раза. Таким образом, МПК концентрата гранатового сока составила 7,8 мл/л, в пересчете на гранатовый сок ― 42,9 мл/л. С учетом известной плотности гранатового сока, равной 1,08 г/см³, МПК гранатового сока составила 46 332 мг/л, или 46,3 г/л.

МПК гранатового сока, равная 46,3 г/л, с учетом отсутствия данных о его фармакокинетике не позволяет сделать точные выводы о кратности приема и объеме гранатового сока, достаточном для его использования в качестве самостоятельного антибактериального средства. Однако при условии 100%-ной биодоступности, не учитывая скорость последующего выведения, при равномерном распределении концентрации в общем объеме крови (принятом в количестве 7% массы тела) и интерстициальной жидкости (принятой в количестве 25% массы тела), при однократном приеме внутрь гранатового сока человеком с массой тела, равной 70 кг, концентрация, равная 42,9 мл/л, для подавления роста стафилококка будет достигнута после перорального приёма 960,96 мл гранатового сока.

С учетом большого объема гранатового сока, необходимого для достижения терапевтического антибактериального эффекта, наиболее значимым остается выделение действующих веществ из гранатового сока для дальнейших исследований. Самым перспективным действующим веществом с антибактериальной активностью считается пуникалагин с известной МПК 250 мг/л. Процентное содержание пуникалагина, находящегося в гранатовом соке в количестве 40 мг/100 см³, или 400 мг/л, составляет приблизительно 0,037%. Если предположить, что антимикробная активность гранатового сока полностью основана на действии пуни-калагина, то будет возможным достижение того же терапевтического антибактериального эффекта при значительном снижении объема лекарственного средства, исключив все сопутствующие неактивные вещества. Таким образом, при МИК 42,9 мл/л гранатового сока было бы необходимо лишь 0,015 мл пуникалагина, что соответствует МИК, равной 17,14 мг/л. Однако истинное практическое зна-27

чение МПК пуникалагина равно 250 мг/л, что отличается от ранее приведенных подсчетов в 14,6 раза. Из чего следует вывод, что пуникалагин ― это не единственное биологически активное вещество с антимикробной активностью, содержащееся в гранатовом соке.

Выводы

МПК амоксициллина с клавулоновой кислотой, равная 8,0 мг/л, соответствует пероральному приему лекарственного препарата в дозировке 500 мг каждые 8 часов. В отношении азитромицина установлена абсолютная резистентность выделенного клинического штамма золотистого стафилококка, в связи с чем МПК не была определена.

Минимальная подавляющая концентрация для концентрата гранатового сока определена как 7,8 мл/л, в пересчете на гранатовый сок ― 42,9 мл/л, что составляет 46,3 г/л. По примерным подсчетам антибактериальный эффект в отношении золотистого стафилококка будет достигнут после перорального приема 960,96 мл гранатового сока.

Антибактериальный эффект гранатового сока связан не только с пуникалаги-ном. Наиболее выгодным с практической стороны подходом остается поиск, а также выделение не только пуникалагина, но и всех иных действующих веществ из гранатового сока с целью разработки на их основе новых антибактериальных препаратов.