Дрожжевые сообщества виноградников Дагестана: численность и видовой состав

Цель работы: изучение основных характеристик структуры дрожжевых грибов – численности и видового разнообразия в условиях виноградников Дагестана.

Материал и методы. Исследовали дрожжевые грибы, изолированные с сортов винограда Ркацители и Молдова, произрастающих в условиях промышленных виноградников на равнине (Хасавюртовский район, с. Муцалаул) и в виде небольших участков в предгорьях (до 1000 кустов, Новолакский район, с. Новочуртах) северной зоны Дагестана. Отбор проб и выделение дрожжей проводили в сентябре 2013-2014 гг. в период технической зрелости винограда, когда дрожжевое население характеризуется обилием. Анализировали ягоды, листья и поверхностный слой почвы (0-5 см), образцы которых отбирали в 6-9 точках опытного участка. Методика отбора и подготовки образцов подробно описана в работах, опубликованных ранее [8, 9]. Для изоляции дрожжей использовали метод прямого выделения с предварительной десорбцией клеток на пробирочном вортексе MSV-3500 и накопительных культур. Посевы проводили на глюкозо-пептонно-дрожжевую среду (GPY agar), куда при первом методе добавляли антибиотик левомицетин, подавляющий рост бактерий. Инкубировали посевы при комнатной температуре, учёт колоний проводили на основе макроморфо-логических признаков, по 2-3 колонии каждого типа выделяли в чистую культуру.

Видовую идентификацию дрожжевых грибов проводили на основе анализа нуклеотидных последовательностей ITS1-5.8S-ITS2 региона и D1/D2 доменов региона 26S (LSU) рДНК. Выделение ДНК и проведение ПЦР производили по специальной методике [10]. Для амплификации использовали праймеры ITS1f (5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTA) и NL4 (5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG). Секвенирование ам- плифицированного региона производили в Научно-производственной компании «Синтол» (Москва). Видовая идентификация осуществлялась сравнением полученных нуклеотидных последовательностей с данными размещенными в генбанке NCBI (ncbi.nlm.nih.gov) и базе данных CBS (cbs.knaw.nl). Проведенный филогенетический анализ был выполнен с помощью программ MAFFT 6 и MEGA4.

Результаты и обсуждение. Количественный состав дрожжевых грибов был определён с учетом вида Aureobasidium pullulans , относящегося к так называемой группе дрожжеподобных грибов, в связи с чем он редко учитывается при подсчёте. Анализ распределения дрожжей по типам субстратов виноградников в 2013 г. показал, что в обеих местностях их наибольшее количество было обнаружено на листьях – 10⁵ КОЕ/г, на ягодах оно уменьшалось и составляло 10²-10⁴ КОЕ/г.

Рис. 1. Численность дрожжевых грибов на различных типах субстратов:

ряды (типы субстратов виноградников): 1 – ягоды, 2 – листья, 3 – почва. 1, 2 – Ркацители и Молдова (с. Муцала-ул), 3, 4 – Ркацители и Молдова (с. Новочуртах)

Минимальную численность наблюдали в почве под сортом Молдова в Муцалауле – менее 102 КОЕ/г, в почвах под Ркацители в обеих местностях она была на уровне 104 КОЕ/г, что соизмеримо с количеством дрожжей на ягодах. Отмечены колебания численности дрожжей по типам субстратов виноградников в 2014 г., но общая тенденция их распределения сохраняется – на растении (ягоды, листья) она выше, чем в почве. Снижение количества дрожжей при переходе от живого растения к почве закономерно, так как она является менее благоприятной средой обитания для дрожжевых сообществ. В осенний период виноградные листья начинают стареть, целостность кутикулы нарушается, резко возрастает количество простых сахаров, доступных дрожжам, численность которых в сравнении с другими типами субстратов соответственно растет. Генетическая идентификация изолятов, выделенных с виноградного растения и почвы в 2013-2014 гг. показала видовое разнообразие дрожжей, обитающих в условиях виноградников (табл. 1).

Список дрожжевых грибов включает 22 вида, в том числе 18 относящихся к аскомицетам, 3 – анаформам аскомицетового аффинитета, 1 – бази-диомицетам. Выделенные виды принадлежат 12 родам, из которых Pichia представлена пятью, Hanseniaspora, Metschnikowia и Candida тремя, а остальные роды одним. Полученный список видов не является окончательным и может быть дополнен при продолжении исследований в последующие годы. Применение в 2014 г. параллельно с методом прямого выделения способа накопительных культур позволило дополнить спектр дрожжей видами S. cerevisiaе и P. manshurica. Ранее через накопительную культуру сахаромицеты выделялись в 8 биотопах центральной и южной части Дагестана [ 9]. Изоляция S. cerevisiae при использовании этого метода подтверждает мнение об их редком присутствии на свежих ягодах винограда – в среднем из тысячи ягод Saccharomyces обнаруживается только на одной [ 11].

Таблица 1. Видовой состав дрожжей виноградников по годам

Вид дрожжей	Год выделения
	2013	2014
Аскомицеты
Aureobasidium pullulans	+	+
Hanseniaspora uvarum	+	+
Hanseniaspora opuntiae	-	+
Hanseniaspora occidentalis	+	-
Kodamaea ohmeri	+	-
Lachancea thermotolerans	-	+
Metschnikowia сhrysoperlae	-	+
Metschnikowia рulcherrima	+	+
Metschnikowia viticola	+	-
Meyerozyma guilliermondii	-	+
Pichia fermentans	+	-
Pichia terricola	+	+
Pichia kudriavzevii	-	+
Pichia manshurica*	-	+
Pichia occidentalis	+	+
Saccharomyces cerevisiaе*	-	+
Saccharomycopsis vini	+	-
Wickerhamomyces anomalus	+	-
Анаморфы
Candida zemplinina	+	+
Candida orthopsilosis	-	+
Candida glabrata	+	-
Базидиомицеты
Rhodotorula mucilaginosa	+	-

Примечание:* - культуры выделены накопи тельным методом с ягод винограда

Таксономический состав дрожжевого населения в годы исследования перестраивался, но имел черты сходства за счёт присутствия стабильно выделяемой из виноградников группы дрожжей – Aureobasidium, Hanseniaspora, Pichia ,

Metschnikowia, Candida. Следует отметить, что среди дрожжей, изолированных из виноградников в 2013- 2014 гг. наряду с широко используемым в практике S. cerevisiae, представляют интерес следующие виды, рассматриваемые, как ресурсные: Aureobasidium pullulans (синтез полисахаридов и меланина), Kodamaea ohmeri (производство ксилита, превращение ксилулозы в ксилит), Rhodotorula mucilaginosa (синтез ауксина), Meyerozyma guilliermondii, который может быть использован для получения витамина - рибофлавина, а также ксилита . Очевидно, что результаты проводимых исследований способствуют поиску и выделению перспективных для использования в биотехнологии видов.

Таблица 2. Состав дрожжей различных субстратов виноградников

Вид дрожжей	Субстрат
	1	2	3
Aureobasidium pullulans	+	+	+
Candida zemplinina	+	+	-
Candida orthopsilosis	-	+	-
Candida glabrata	-	-	+
Hanseniaspora uvarum	+	+	+
Hanseniaspora opuntiae	-	+	-
Hanseniaspora occidentals	+	+	-
Kodamaea ohmeri	-	+	+
Lachancea thermotolerans	+	+	-
Metschnikowia chrysoperlae	+	+	+
Metschnikowia pulcherrima	+	+	+
Metschnikowia viticola	+	+	+
Meyerozyma guilliermondii	-	+	-
Pichia aff. fermentans	-	+	-
Pichia aff. fermentans	+	-	+
Pichia kudriavzevii	+	+	-
Pichia manshurica*	+	-	-
Pichia occidentalis	+	+	-
Saccharomyces cerevisiaе*	+	-	-
Saccharomycopsis vini	-	+	-
Rhodotorula mucilaginosa	+	+	-
Wickerhamomyces anomalus	-	+	-
Количество видов	14	18	8

Примечание: 1 - ягоды, 2 - листья, 3 - почва

Анализ распределения видов дрожжей в системе виноградное растение - почва, представленный в табл. 2 показал, что максимальным видовым разнообразием отличалась группа дрожжевых грибов, изолированных с листьев, минимальным из почвы - 18 и 8 видов, соответственно.

Исследование, проведенное ранее в динамике (июнь-декабрь) выявило наибольшее видовое разнообразие на ягодах. Максимальное количество видов для них приходилось на август-октябрь, для листьев - на сентябрь-октябрь, а для почвы - на октябрь-ноябрь. Частично это явление может быть объяснено «круговоротом» дрожжей - их постепенной миграцией из растения в почву, что является наиболее показательным по выделению из почвы дрожжевых грибов родов Metschnikowia и Hanseniaspora , являющихся типичными обитателями цветков и сочных плодов [ 8] . Приуроченность ко всем типам субстратов отмечена у 5 видов - A. pullulans, H.uvarum, M. сhrysoperlae, M. рulcherrima, M.viticola и к одному у 9 – H. opuntiae, M.guilliermondii, P. aff. fermentans, P. manshurica, S. cerevisiaе, S. vini, C.orthopsilosis, C. glabrata, W. anomalus.

Для выявления особенностей организации дрожжевых грибов на виноградниках целесообразным было проведение сравнения их таксономического состава в зависимости от таких факторов, как сорт винограда и экологические условия произрастания. Видовое разнообразие дрожжевого населения разных сортов оценивали на примере Молдовы и Ркацители, культивируемых на двух смежных участках в равнинной зоне (с. Муцалаул), что сводило к минимуму влияние других факторов. Для сопоставления дрожжевых сообществ схожих субстратов в разных экологических ситуациях рассматривали сорт Молдова, выращиваемый на равнине и предгорье. Согласно данным, приведенным в табл.3, число видов, изолированных из разных сортов, различалось и было представлено на Ркацители и Молдове - 15 и 7 видами, соответственно, из которых 5 являются общими для обоих сортов.

Таблица 3. Состав дрожжей, изолированных с различных виноградников

Вид дрожжей	Место произрастания, сорт
	Новочуртах	Муцалаул
	Молдова	Молдова	Ркацители
1	2	3	4
Aureobasidium pullulans	+	+	+
Candida zemplinina	+	-	-
Candida orthopsilosis	-	+	-
Candida glabrata	-	-	+
Hanseniaspora uvarum	+	+	+
Hanseniaspora opuntiae	+	+	-
Hanseniaspora occidentalis	+	-	-
Lachancea thermotolerans	+	+	+
Metschnikowia chrysoperlae	-	-	+
Metschnikowia pulcherrima	+	+	+

Metschnikowia viticola	-	-	+
Meyerozyma guilliermondii	-	-	+
Pichia aff. fermentans	-	-	+
Pichia terricola	+	-	+
Pichia kudriavzevii	+	-	+
Pichia manshurica*	-	-	+
Pichia occidentalis	+	-	-
Rhodotorula mucilaginosa	+	-	+
Saccharomyces cerevisiaе*	-	-	+
Saccharomycopsis vini	-	-	+
Количество видов	12	7	15

Отмечено таксономическое разнообразие дрожжевых группировок Молдовы в зависимости от среды произрастания, показавшее, что в условиях равнины из сорта было изолировано 7 видов, предгорий 12. обоих случаях наблюдается сходство дрожжевого сообщества виноградников, обусловленное тем, что изолированные с разных сортов и местностей виды объединены в составе общих для них родов – Aureobasidium . Candida, Hanseniaspora, Metschnikowia Lachancea.

Выводы: исследованы основные характеристики дрожжевых грибов виноградников в северной зоне Дагестана. Показана дифференциация их численности и таксономического состава в про-странственно-сукцесионном ряду – максимальная численность и количество видов обнаружены на растении, минимальные в почве под виноградом. Дрожжевое население виноградников включает представителей Aureobasidium, Candida, Hanseni-aspora, Metschnikowia, встречаемость которых независимо от сорта и условий произрастания регулярна, что обусловливает сходство его структуры. Список дрожжевых грибов виноградников представлен 22 видами, из которых 21 относится к ас-комицетам. Показана выделяемость широко используемых в практике культур S. cerevisiae, а также ряда других, имеющих большой потенциал как ресурсные.