Исследование поведенческой активности экспериментальных животных под действием бактериальной добавки

Аграрная наука, интегрируя достижения биотехнологий, содействует повышению эффективности и конкурентоспособности сельскохозяйственного производства [1, 2]. Ввиду неполноценности привозных комбикормов актуальным является использование кормовых добавок для повышения биологической ценности рационов [3]. Альтернативой антибиотикам являются метаболиты микроорганизмов, которые отличаются исключительной устойчи- востью и многофункциональностью. Однако существующие коммерческие штаммы (чаще всего Bacillus subtilis) не всегда полностью решают все задачи животноводства [4, 5]. Это создает необходимость в поиске и внедрении новых, более эффективных пробиотических штаммов. Бактерии рода Paenibacillus продуцируют широкий спектр внеклеточных ферментов (протеазы, амилазы, целлюлазы, ксиланазы), которые эффективно расщепляют трудно-перевариваемые компоненты корма (белки, крахмал, клетчатку), высвобождая больше питательных веществ, синтезируют мощные антимикробные пептиды и вещества (бактериоци-ны), подавляющие рост патогенов (E.coli, Salmonella, Clostridium). Бактерии Paenibacillus не просто конкурируют с патогенами, а целенаправленно подавляют их рост, «очищая» среду для полезной микрофлоры, модулируют иммунный ответ, повышая устойчивость животных к инфекциям. Изученный штамм обладает всеми перечисленными свойствами, использование которых определяет перспективное направление для получения многофункциональных кормовых добавок.

О безопасности кормовых добавок можно судить по анализу поведенческих реакций экспериментальных животных. Кормовая добавка, способствующая снижению уровня стресса, может привести к увеличению привеса, улучшению репродуктивной функции и снижению агрессивности. Исследование поведенческих реакций экспериментальных животных при применении кормовых добавок представляет собой одну из важных задач для обеспечения их безопасности и эффективности. Подобные исследования не только позволяют оценить потенциальные преимущества, но и выявить возможные негативные последствия для животных.

Исследуемая кормовая добавка разработана на основе бактерий Paenibacillus polymyxa (штамм ВСГУТУ-1 (RU 2 784 088 C1)). Известно, что данные бактерии являются продуцентами антимикробных липопептидов, полимиксинов [6, 7], обладающих ингибирующей активностью против грамотрицательных бактерий [8, 9], и экзополисахаридов [10, 11], обладающих противоопухолевой, антиоксидантной, антибактериальной, противовоспалительной, иммуномодулирующей и пробиотической активностями [12, 13, 14].

Цель работы – изучить влияние кормовой добавки на поведенческую реакцию экспериментальных животных.

Материалы и методы исследования

Кормовая добавка представляет собой микробный препарат на основе бактерий Paenibacillus polymyxa (штамм ВСГУТУ-1) с концентрацией клеток не менее 1×10⁹ кл/г и пшеничных отрубей.

Экспериментальное исследование выполнено на 28 половозрелых крысах линии Wistar массой 157±16,3 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и корму. В рамках эксперимента были сформированы контрольная и экспериментальные группы животных, получавшие добавку в различных вариантах: № 1 – контрольная (животные, не получавшие ничего дополнительно к основному рациону); № 2 – опытная, в рацион которых вводился наполнитель кормовой добавки – кормовые отруби взамен 13 % рациона; № 3 – опытная, которым добавляли жидкий бактериальный препарат в дозе 0,5 % от суточной массы корма, № 4 – опытная, которой вводилась добавка в количестве 13 % от рациона (бактериальный препарат в дозе 0,5 % от суточной массы корма и 12,5 % отруби). Опытным группам № 3 и № 4 вводили 0,5×109 - 2×109 КОЕ/гол [15, 16]. Объем корма не различался у всех групп. Особое внимание уделялось условию содержания и минимизации стрессовых факторов, чтобы обеспечить достоверность полученных данных. Животные содержались в стандартных условиях вивария в соответствии с правилами содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами, изложенными в «Руководстве по содержанию и уходу за лабораторными животными» (Евразийский совет по стандартизации, метрологии и сертификации, Минск, 2014). Содержание лабораторных животных соответствовало рекомендуемой нормативной документации (ГОСТ 33216-2014). Уход и все мани- пуляции с животными выполнялись в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS N 123).

Поведенческая активность крыс оценивалась тестом «Открытое поле». Для очистки установки и снижения влияния на поведение посторонних запахов (вследствие пребывания предыдущего животного) перед каждым тестированием установка протиралась смоченной водой салфеткой, салфеткой, смоченной 5%-ным раствором спирта, и сухой. После полного высыхания поверхности установки испытуемое животное помещалось в центральную зону «открытого поля» и велось наблюдение за его поведением в течение 3 мин [17, 18]. Оценка результатов проводилась по методике С.Ю. Буслович и соавторов [19]. Исследовательскую активность определяли как сумму баллов за следующие показатели: латентное время выхода из центра (минус 0,5 балла за 1 с), горизонтальную двигательную активность (1 балл за 1 сектор), вертикальные стойки (3 балла за 1 стойку без упора и 2 балла за 1 стойку с упором), выход в центр (5 баллов). Общий уровень тревожности определяли как сумму баллов за следующие показатели: короткие груминги (1 балл), количество болюсов (1,5 балла), количество актов уринации (2 балла), атипические реакции в поведении (4 балла). Для оценки уровня тревожности животного изучали поведение крыс в условиях переменной стрессоген-ности в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ). После очистки, описанной выше, и полного высыхания поверхности установки испытуемое животное помещалось на пересечении закрытых и открытых рукавов - в центр лабиринта. Наблюдение за его поведением велось в течение 3 мин [17]. Регистрировалось время, проведенное в открытых и закрытых рукавах, количество переходов в разные части лабиринта, количество вертикальных стоек, заглядываний вниз с рукавов лабиринта, а также количество груминга [20].

Статистическую обработку данных проводили в программе Statistica for Windows 6.0. Соответствие анализируемых признаков закону нормального распределения оценивали, используя критерий Шапиро - Уилка. Значимость различий между данными групп определяли с помощью t-критерия Стьюдента при условии, что выборка имеет нормальное распределение; данные представляли в виде средней арифметической и ошибки средней арифметической (М±m). В случае если данные не подчинялись нормальному распределению вероятности, использовали критерий Манна - Уитни; полученные данные представлены в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей (Med (LQ; UQ). Для сравнения количества животных в группах сравнения использовали ф - критерий углового преобразования Фишера. Различия между опытными и контрольной группами считали значимыми при p<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

В таблице 1 представлены результаты по оценке ориентировочно-исследовательских реакций и скрытого эмоционального напряжения подопытных животных, зафиксированных в тесте «Открытое поле».

Таблица 1

Показатели поведенческих реакций животных в тесте «Открытое поле»

Показатель	Группа № 1 (n=7)	Группа № 2 (n=7)	Группа № 3 (n=7)	Группа № 4 (n=7)
Количество пересеченных квадратов	150,5 (116,5; 184,5)	126,4 (110,0; 142,8)	145,2 (122,6; 167,8)	118,2 (104,8; 131,6)
Вертикальная двигательная активность	31,8 (23,4; 40,2)	18,8 (14,6; 23,0) p<0,1	26,8 (22,2; 31,4)	19,0 (10,6; 27,4) p<0,1
Центральное посещение, частота	5,5 (4,0; 6,5)	4,0 (2,5; 5,5)	7,0 (3,5; 10,0) p<0,1	2,8 (1; 4,5) p<0,1
Груминг, частота	1,8 (0-3,5)	3,4 (1; 6) p<0,1	1,5 (0; 2)	2,0 (0,5; 3)
Болюсов (количество)	отсутствует	отсутствует	отсутствует	1 на группу

Таблица 2

Влияние кормовой добавки на исследовательскую активность и интегральную оценку тревожности экспериментальных животных

Показатель	Группа № 1 (n=7)	Группа № 2 (n=7)	Группа № 3 (n=7)	Группа № 4 (n=7)
Исследовательская активность, усл. ед.	238,6	183	230,3 p<0,1	176,7
Уровень тревожности, усл. ед.	1,8	3,4	1,2 p<0,1	2,1

Как следует из таблицы 2, у животных, получавших отруби в качестве кормовой добавки (группа № 2), наблюдалось снижение исследовательской активности на 23,3 % (до 183 усл. ед.) и повышение уровня тревожности в 1,9 раза (до 3,4 усл. ед.) по сравнению с контрольной группой. Введение в рацион концентрата кормовой добавки (группа № 3) оказывало выраженный положительный эффект. Исследовательская активность у этих животных практически на уровне контроля, составив 230,3 усл. ед. (что на 25,8 % выше, чем в группе № 2), а уровень тревожности оказался даже на 33,3 % ниже контрольного значения, достигнув 1,2 усл. ед. (и снизившись на 64,7 % по сравнению с группой 2). Это свидетельствует не только о полной компенсации негативных эффектов, но и о возможном благотворном нормализующем влиянии добавки. Исследовательская активность у группы № 4 была снижена на 26 % относительно контроля (176,7 усл. ед.), однако уровень тревожности (2,1 усл. ед.) был лишь незначительно выше контрольного (на 16,7 %) и существенно ниже, чем в группе № 2 (на 38,2 %). Это указывает на снижающий тревожность эффект данной формы добавки.

В целом анализ поведенческих данных в тесте «Открытое поле» продемонстрировал, что ориентировочно-исследовательская реакция у крыс опытных групп № 3 и № 4 были сравнимы с показателями контрольной группы. По отдельным показателям наблюдались отклонения, которые мы сочли незначимыми (р<0,1). Данные по оценке уровня тревожности, полученные в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт», представлены в таблице 3.

Таблица 3

Приподнятый крестообразный лабиринт

Показатель		Группа крыс
		группа № 1	группа № 2	группа № 3	группа № 4
Время пребывания, с	о	96,0±24,8	56,0±15,2	63,0±16,5	75,0±18,0
	з	84,0±23,8	124,0±35,1	117,0±36,8	105,0±38,3
Соотношение времени, % к общему	о	53,3	31,1	35,0	41,6
	з	46,7	68,9	65,0	58,3
Количество переходов		2,0±0,4	1,2±0,3	2,2±0,4 p<0,1	1,6±0,5 p<0,1
Количество вертикальных стоек в рукавах	о	0	0	0	0
	з	2,4±0,5	4,6±1,5	3,6±0,6 p<0,1	4,0±0,8
Количество заглядываний вниз		4,8±1,2	2,6±0,5 p<0,1	4,4±1,1	5,0±1,6
Груминг (частота)	о	0	0	0	0
	з	1,2±0,3	1,4±0,5	0,5±0,2	0,7±0,2 p<0,1

Примечание: «о» – открытые рукава, «з» – закрытые рукава.

Как видно из представленных данных в таблице 3, время, проведенное на открытых рукавах ПКЛ, изменилось у крыс, принимавших наполнитель кормовой добавки, у которых наблюдалось снижение данного показателя на 41,7 % по сравнению с контрольной группой.

У двух оставшихся групп данные показатели были сопоставимы как между собой, так и с контрольной группой. Такая же тенденция наблюдалась для такого показателя, как количество переходов между рукавами: изменения коснулись только группы № 2, где произошло его снижение на 40 %.

Наблюдения за испытуемыми животными показали, что на открытых рукавах они не вставали на задние лапы, в отличие от закрытых рукавов – там количество вертикальных стоек в опытных группах № 2, 3 и 4 в 1,9, 1,5 и 1,6 раза соответственно превышало контрольную группу. Количество заглядываний вниз с открытых рукавов у групп № 4 и 3 было в пределах показателей контрольной группы, тогда как в группе № 2 оно оказалось в 1,8 раза меньше, чем в контрольной группе.

Анализируя вышеперечисленные показатели, можно сделать вывод, что ориентировочно-исследовательская деятельность у всех экспериментальных животных не менялась, за исключением группы крыс, в корм которых был добавлен наполнитель кормовой добавки – у них наблюдалось некоторое снижение (p<0,1). Оценивая уровень тревожности крыс в этом тесте, можно заключить, что в группе, которая получала микробный препарат, он был ниже, чем у остальных групп. Введение в корм наполнителя кормовой добавки – отрубей, привело к негативному воздействию на исследовательскую активность и уровень тревожности. На основании исследований влияния отрубей на крыс-отъемыщей [21] и полученных данных можно предположить, что использование отрубей не подходит для данного вида животных.

Заключение

Таким образом, результаты анализа полученных данных по оценке влияния бактериальной добавки на ориентировочно-исследовательскую активность и уровень тревожности в тестах «Открытое поле» и «Приподнятый крестообразный лабиринт» показывают, что использование микробной составляющей экспериментальной кормовой добавки не привело к значимым изменениям показателей у испытуемых животных. В обеих группах подопытных крыс не было зарегистрировано ни достоверных отклонений в двигательной и познавательной активности, ни повышения уровня тревожности. Полученные результаты указывают на безопасность микробного концентрата кормовой добавки.

Работа выполнена в рамках «Приоритет 2030» № 075-15-2025-049 от 29 марта 2025 г.