Изучение биологических свойств пробиотических компонентов в йогуртах и айране

В настоящее время человек употребляет в пищу продукты, в большинстве своем рафинированные и обогащенные легко усваиваемыми углеводами, но лишенные балластных веществ и витаминов, пищевых волокон и других крайне необходимых компонентов [1].

Соотношение таких веществ как омега-6 к омега-3 жирным кислотам в продуктах питания показывает насколько сильно изменилась диета современного человека, причем в негативную сторону. Это соотношение в пище наших предков составляло 2:1, у современных эскимосов это соотношение равно 1:1, у жителей других прибрежных стран оно может достигать 10:1, а у населения континентальной суши это соотношение близко к 30-50:1 [2].

Для решения создавшихся проблем в сфере питания, отечественными и зарубежными учеными предпринимались неоднократные попытки создать единую систему правил, включающую перечень необходимых питательных ингредиентов и режим их поступления в организм человека [3].

Одной из первых, в начале 80-х годов ХХ века, стала теория адекватного питания академика А.М. Уголева. Данная теория раскрывала процессы ассимиляции пищи и трофических взаимоотношений на всех уровнях организации биологических систем. В ее основе лежит следующее положение: питание должно поддерживать молекулярный состав и возмещать энергетические и пластические расходы организма, связанные с основным обменом, ростом и выполненной работой, а также пища должна состоять не толь -ко из нутриентов, но также из балластных веществ, то есть пищевых волокон. Далее в медицинской науке была разработана и принята концепция оптимального питания. Эта система значительно расширила спектр питательных веществ, необходимых для организма. Так, к прежде регламентированным источникам жира, энергии и пластического материала (липиды, белки, углеводы) были добавлены микронутриенты, которые, выступая на минорных ролях, также необходимы для нормальной жизнедеятельности человека. Изучая всю необходимость таких минорных компонентов как витамины, минеральные вещества, микроэлементы, полифенолы и др. и пути их поступления в организм человека, было разработано на базе концепции оптимального питания новое направление науки о питании - концепция функционального питания или функциональной пищи. Впервые она была сформулирована японскими учеными в 1989г. Нужно отметить тот факт, что первый ферментированный кисломолочный продукт на основе лактобацилл был разработан и произведен также в Японии, и вышел он в 1955 г. под лозунгом «хорошая микрофлора кишечника обеспечивает здоровый организм». В развитых странах, и конечно, в самой Японии сектор подобного рода продуктов и напитков имеет первостепенное значение на данный момент [4].

В Японии в 1991г. данная категория продуктов питания получила название FOUSHU - Foodsforspecifiedhealthuse, там же были сформулированы условия, определяющие данную пищу: это натуральная пища (не капсула, таблетка, порошок), она входит в состав ежедневного рациона, при постоянном употреблении оказывает оздоровительный эффект на организм человека[5].

Мировой рынок функциональных продуктов интенсивно развивается, ежегодно увеличиваясь на 15-20%. О популярности этих продуктов в европейских странах, США и Японии свидетельствует статистика качественных изменений продовольственного рынка. Сегодня мировой рынок продаж функциональных продуктов превышает 50 миллиардов долларов. В Японии рынок функционального питания оценивается в 8-9 миллиардов долларов в год, а его производство стало стратегическим направлением страны. В США ежегодно из федерального бюджета выделяются миллионы долларов на дотацию для обогащения пищевых продуктов натуральными БАД. По официальным данным, почти 40% рынка функциональных продуктов принадлежит США. Во Франции объем производств пробиотических продуктов за последнее десятилетие возрос в 350 раз. Потенциал мирового рынка функциональных продуктов питания на данный момент - 5% от всего объема.

Рынку продуктов функционального питания в Казахстане всего около восьми лет, но он стремительно развивается. Продукты функционального назначения здесь представлены четырьмя группами: продукты на основе зерновых (добавление отрубей, сухие зав- траки, хлебобулочные и кондитерские изделия), безалкогольные напитки (соки, морсы, квасы, чаи, содержащие функциональные ингредиенты), молочные продукты, продукты масложировой отрасли (комбинированные и облегченные масла, майонезы) [6].

Но, несмотря на большое разнообразие ассортимента функциональных продуктов, первой в этой группе стала молочная продук -ция. Традиционно она была представлена кисломолочными продуктами на основе ацидофильных молочнокислых палочек. Их можно назвать первыми пробиотическими продуктами, так как в клинике было доказано их лечебно-профилактическое действие при различных желудочно-кишечных заболеваниях.

Качество имеющихся на рынке пробиотических препаратов также вызывает некую беспокойность. Проведенные в США экспертные исследования качественного и количественного состава пробиотических препаратов, показали, что из 13 имеющихся на рынке США пробиотических препаратов (5 предназначенных для человека и 8 - для животных), только у 2 препаратов было соответствие в составе и концентрации микроорганизмов с заявленной в аннотации к препарату, у 5 не было выявлено 1 или более штаммов, указанных в аннотации, а в 3 из этих 13 содержались микроорганизмы, о которых не говорилось в аннотации. Концентрация микроорганизмов также не соответствовала и варьировала от 0,008% до 215% от заявленной.

Принципиальными недостатками реализуемых на территории Казахстана комплексных пробиотических препаратов нужно считать неадаптированность использованных в них штаммов микроорганизмов для казахстанской популяции людей, присутствие в их составе штаммов бактерий с потенциальной способностью вызывать в ослабленном организме гнойно-воспалительные процессы (например, энтерококков), а также высокую стоимость этих препаратов, ограничивающих лечебно-профилактическое их применение всеми группами населения, независимо от социального статуса.

Таким образом, учитывая все многообразие пробиотиков и продуктов функциональ -ного питания, а также перспективу развития данной области биотехнологии для Казахстана, необходимо при конструировании новых пробиотиков проводить тщательное исследование степени выраженности, механизмов воздействия и эффективности пробио- тиков, фармакокинетики и адаптированности действующих начал данной категории средств поддержания здоровья человека [7].

Целью работы является иccледование биологических свойств пробиотических ком- понентов в йогуртных напитках и домашнего айрана.

Лабораторные исследования проводились в «NationalLaboratoryAstana» при Назарбаевском Университете. Работы исследования проводились по следующей схеме:

Рисунок 1 – Блок-схема проведения исследования

Объекты и методы исследований

Культуры молочнокислых бактерий были выделены из йогуртных напитков и домашнего айрана. Была проведена видовая идентификация всех изолятов, для проведения дальнейших исследований, связанных с изучением биологических свойств данных культур .

Из различных молочнокислых напитков отбирали по 1мл (г) образца, который переносили в 9 мл нейтрального физиологического раствора, после чего тщательно перемешивали. После гомогенизации производили последующие разведения. В пробирки под номерами №2-9 вносили по 4,5 мл стерильного нейтрального физиологического раствора. Из первого разведения пипеткой объемом 1 мл переносят 0,5 мл полученной суспензии в пробирку №2. При этом желательно, чтобы кончик пипетки был прислонен к пробирке с внутренней стороны, но не касался жидкости содержащейся в ней. После каждого переноса пипетку меняют на аналогичную и тщательно перемешивают жидкость в пробирке №2 методом пипетирования, таким образом получали разведение 10-2. После гомогенизации этой же пипеткой отбирают 0.5 мл и переносят в следующую пробирку, и так до последнего разведения. Посев 1 капли суспензии производится параллельно на 2 чашки Петри с элективными культуральными средами, для этих целей преимущественно используют разведения от 10-5 до 10-8.

Результаты и их обсуждение

Источниками выделения молочнокислых бактерий в наших исследованиях были питьевые йогурты, как промышленного производства отечественных фирм производителей, так и приобретенные у частников, т.е. приготовленные в домашних условиях. Общее число исследованных образцов составило 7, в итоге было выделено 20 культур молочнокислых бактерий. Источники выделения МКБ представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Источники выделения МКБ

Обозначение изолята	Источник выделения	Производитель
Л- 001, Л- 002,Л -003	Питьевой йогурт "Бурёнкины мечты"	"Эмиль" Усть-Каменогорск
Л- 004, Л- 005, Л-006	Питьевой йогурт "Биойогурт клубника"	"Биобаланс" Россия
Л- 007, Л-008, Л-009	Питьевой йогурт "Активиа со злаками"	"Danone" Россия
Л- 010, Л- 011, Л-012	Йогурт "Активиа чернослив"	"Danone" Россия
Л- 013, Л-014, Л-015	Айран	домашний (Астана)
Л- 016, Л-017, Л-018	Питьевой йогурт "Био-С Имун+"	"FoodMaster" Алматы
Л- 019, Л-020	Питьевой йогурт "Чудо вишня черешня"	"Вимм Билль Данн" Россия

Выделение культур осуществлялось с использованием специальных сред, предназначенных для выраженного роста молочнокислых палочковых и кокковых форм и угнетающих рост посторонней микрофлоры (МРС-4, Сабуро, МПА). Посев на питательные среды был сделан газонным методом. После чашки Петри поставили в термостат на 48 часов. Были отобраны штаммы, которые являлись грамположительными бесспоровы-ми неподвижными палочками или кокками, были каталазоотрицательными.

Отдельные штаммы были сгруппированы, так как обладали некоторой схожестью формы, размера и цвета колоний, а также при микроскопировании клетки обнаруживали схожие морфологические признаки.

Рисунок 2 – Рост колоний выделенных изолятов МКБ на среде МРС-4 и ЕПА

Микроскопирование было проведено с помощью микроскопа Карл ЗейцаAxioImager 2. Уже по результатам первых исследований было очевидно, что собранные культуры имеют как палочковые, так и кокковые виды молочнокислых бактерий, т.е. присутствуют виды Lactobacillus spp и Streptococcus spp (представлено на 2 рисунке).

Деление на виды молочнокислых бактерий как Lactobacillus spp так и Strepto-coccusspp производили с учетом ферментативной активности, в расчет брали способность бактерий сбраживать определенные углеводы с образованием молочной кислоты.

Рисунок 3 – Микроморфология МКБ. А – Streptococcus spp ., Б – Lactococcus spp ., В – Lactobacillus spp.

Данное исследование помогло выделить нам несколько отдельных видов лактобацилл, стрептококковилактокков: Lactobacillus delbrueckii (5 штаммов), Lactobacillus acidophilus (3 штамма), Lactobacillus casei (3 штам- ма), Streptococcus thermophilus (4 штамма), Lactococcuslactis (5 штаммов).

Для проверки антагонистической активности штаммов по отношению к основным патогенными условно-патогенным микроор- ганизмам, заселяющим желудочно-кишечный тракт человека: E.coli, Proteus mirabilis, Klebsiellaozaenae, Streptococcus pyogenes,

Staphylococcus aureus, Candida albicans, Salmonella typhimurium. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Антагонистические свойства молочнокислых бактерий

Патогенные штаммы Пробиотические штаммы	й о о О й о ад й	й S о 2 £ g	cd О N 3 О	5 и 8 5	ГУ § § О <	cd § •5 rs 00 К	О Щ
L. lactisЛ-013	8,5±0,3	10,1±0,7	5,7±0,1	21,3±1,0	12,5±0,3	24,2±0,8	22,3± 0,3
L. delbrueckiiЛ-009	10,4±0,4	14,2±0,5	9,4±0,4	13,2±1,1	11,4±0,2	12,2±0,35	19,8±0,2
L. delbrueckiiЛ-012	16,5±0,8	20,5±1,2	23,1±0,34	26,5±0,8	15,0±1,0	21.4±0,78	23,5±0,6
L.lactisЛ-016	9,2±0,77	5,2±0,78	12,11±0,9	9,2±1,3	4,5±0,7	6,2±0,9	8,2±0,4
S.thermophilusЛ-018	14,3±0,34	9,4±0,56	16,5±0,8	5,3±0,2	5,2±0,6	11,3±0,45	10±1,0
L.delbruesckiiЛ-007	10,2±0,3	8,5±0,55	8,2±0,77	12,5±1,2	7,3±0,33	12,6±0,9	16,9±1,4

Полученные в ходе эксперимента результаты свидетельствовали о способности подавлять рост, причем высокий, таких бактерий как Escherichiacoli, Serratiamarcescens, Klebsiellaozaenae, Streptococcuspyogenes, Staphylococcusaureus, Salmonellatyphimurium, Candidaalbicans, Proteusmirabilisу всех штаммов, но в особенности у L. delbrueckiiЛ-012, L. lactisЛ-013 и L. delbrueckiiЛ-009.

Заключение

Были выделены 20 культур молочнокислых бактерий из йогуртных напитков и домашнего айрана. Была проведена их видовая идентификация с использованием метода сбраживания 16 углеводов, которая позволила 5 (35%) изолятов отнести к Lactobacillusdel-brueckii, 3 (15%) - Lactobacilluscasei, 3 (15%) -Lactobacillusacidophilus, 4 (20%) - Streptococcusthermophilus и 5 (25%) пришлось на Lactococcuslactis. Были изучены культуральноморфологические свойства всех изолятов. Взаимосвязь между формой образуемых колоний и числом сбраживаемых углеводов внутри одного вида бактерий нами не была прослежена. Анализ антагонистических свойств отобранных штаммов показал их наибольшую активность против таких микроорганизмов как Escherichiacoli, Serratiamarcescens, Klebsiel-laozaenae, Streptococcuspyogenes, Staphylococcu-saureus, Salmonellatyphimurium, Candidaalbicans, Proteusmirabilis.

Таким образом, исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что большинство выделенных нами штаммов пробиотических микроорганизмов, входящих в состав различных йогуртных напитков, обладают биологическими свойствами, необходимыми для использования их как компонентов питьевых йогуртов и айрана.