Современные конкреции: минералогическое исследование и экспериментальный подход. Часть 2. Эксперименты по осаждению карбонатов с помощью бактериальных сообществ

Эксперименты по осаждению карбонатов в лабораторных условиях бактериальными сообществами, взятыми из природных экосистем, начаты нами в 2014 году. Первоначальной задачей работы было изучение гетеротрофных бактериальных сообществ и чистых культур бактерий, ассоциирующих с минеральными образованиями пещеры Шульган-Таш, и оценка их способности осаждать биокарбонаты in vitro. Однако в процессе работы выяснилось, что результаты экспериментов имеют более широкое значение и могут объяснить, в частности, процесс отложения карбонатов в таких литологических образованиях, как карбонатные обособления, цемент песчаников и конкреций песчаникового типа, а также корки, цементирующие макрофоссилии в рифо- генных телах, и структуры «строма-тактис» в иловых холмах.

Объект и методы исследования

Для исследований в качестве биоинокулянтов были взяты минеральные образования пещеры Шульган-Таш, происхождение которых считается дискуссионным. Это нитевидные агрегаты кальцита (needle-fibre calcite,

NFC) или “лунное молоко” (мондмильх) (рис. 1, а, б), отобранные с потолка зала Верхний. Известно, что мондмильх также образуется в трещинах и полостях известняков, в пустотах почв на карбонатных почвообразующих породах по всему миру [6,11]. Механизм формирования нитевидных агрегатов исследователи объясняют хемогенным осаждением кальцита из пара за счет роста частиц на множественных центрах кристаллизации [5] или путём водно-хемогенного отложения при неустойчивых условиях кристаллизации [3]. Согласно биогенной гипотезе, активно обсуждающейся в последнее время, нитевидные кристаллы интерпретируются как кальцификаты гифов грибов или актинобактерий [6]. Однако остаётся необъяснимой прямолинейная форма нитей кальцита (рис. 1, б).

Другим биоинокулянтом послужили кальцитовые образования — “бассейновые пальцы” (Pool fingers) (рис. 1, в, г), взятые ниже уреза воды в слабопроточном подземном водоеме Дальнее Верхнее озеро пещеры Шуль-ган-Таш, где максимальная их длина достигает 1.5 метров. В агрегатах Pool fingers при протравливании кислотой наблюдается осевой нитевидный ка

Рис. 1. Минеральные образования пещеры Шульган-Таш (Башкортостан, д. Иргиз-лы), используемые в качестве биоинокулянтов: а — нитевидные агрегаты кальцита (needle-fibre calcite, NFC), или "лунное молоко" (мондмильх), б — микрофотография (СЭМ) мондмильха; в — кальцитовые образования «бассейновые пальцы» (Pool fingers), г — микрофотография (СЭМ) «бассейновых пальцев»

Fig. 1. Mineral formations of Shulgan-Tash cave (Bashkortostan, Irgizly settlement) used as bioinoculants: a — filamentary aggregates of calcite (needle-fibre calcite, NFC), or "moon milk" (mondmilh), б — micrograph (SEM) ofmondmilh; в — calcite formation “poolfingers”, г — micrograph (SEM) of “pool fingers”

нал, который связывается с фоссили-зацией нитчатых форм железобактерий [9].

Также в качестве биоинокулянтов использовались грунт из зала Радужный и маломощная серая лесная почва с поверхности пещерного массива над залом Верхний.

Предпосылкой наших экспериментов послужил тот факт, что осаждение карбонатов происходит при участии цианобактериальных сообществ, вторичных анаэробов (денит-рификаторов, сульфатредукторов, метаногенов), аэробов, использующих летучие жирные кислоты (ЛЖК), и аммонификаторов-деструкторов [1].

В процессе работ по эксперименту 1 решались вопросы: будут ли развиваться бактериальные сообщества этих геоэкосистем в лабораторных условиях и отлагать минералы? Для выделения гетеротрофных бактерий использовали питательные среды с белковыми гидролизатами (ГМФ) и органическими кислотами, для отверждения сред использовали агар (15 г/л), рН доводили до 7 добавлением NaOH. В экспериментах использовались следующие составы сред, (г/л):

• 1)    ГМФ (НПЦ «Биокомпас») (ферментативный гидролизат мяса —

10.0, дрожжевой автолизат — 2.0. NaCl — 5.0);

• 2)    Gran’s [8] (измененная) (г/л): CaCl₂-2H₂O — 3.3, KNO₃ — 0.5, Na 2 HPO₄-12H₂O — 0.25, яблочная кислота — 4.02;

• 3)    Variant 3 [7] (измененная) (г/л): CaCl₂-2H₂O — 3.3, KNO₃ — 0.5, Na 2 HPO₄-12H₂O — 0.25, янтарная кислота — 3.54;

• 4)    среда с ЛЖК [2] (измененная) (г/л): MgSO₄-2H₂O — 0.2, CaCl₂ — 2.0, Na-соли кислот (уксусной или масляной) — 2.0, (NH₄)₂HPO₄ — 0.5, NаCl — 0.1,;

• 5)    среда Ван Дельдена (измененная) (г/л): MgSO 4 -7H 2 O — 1.0, лактат Ca — 5.0, аспарагин — 1.0, K 2 HPO 4 — 0.5, Fe(NH₄)₃(SO₄)₃ — следы;

• 6)    пептонная вода (измененная) (г/л): CaCl₂ — 2, MgSO 4 -7H₂0 — 0.5, пептон — 5.0, K₂HPO₄ — 1.0, KH₂PO₄ — 1.0, NаCl — следы.

Выделение и учет численности микроорганизмов природных образцов проводились методом последовательных разведений суспензий из образцов и высева на питательные среды в чашках Петри [2], инкубацию посевов производили 21 сутки при температуре +22 °С, для оценки степени бактериального кристаллообразования чашки со средой просматривали на оптическом микроскопе (Leica DM1000). Количество выросших микроорганизмов подсчитывали и оценивали в численности колониеобразующих единиц на 1 г сухого образца или грунта (КОЕ/г). Минеральные фазы (биоинокулянты и новообразования) изучались методами сканирующей электронной микроскопии (СЭМ, JSM-6390LV JEOL, углеродное напыление), энергодисперсионной спектрометрии (ЭДС, Inca Energy 450), рентгеновской дифрактометрии (Shimadzu XRD-6000, излучение — CuK _a , Ni фильтр, 30 кВ, 20 mA, интервал сканирования 2 0 = 2—55 и 20—55°).

Результаты

В процессе работы было установлено, что в грунте и минеральных образованиях пещеры, а также в почве над пещерой присутствуют в большом количестве аэробные гетеротрофные бактерии, использующие в процессе жизнедеятельности кальциевые соли органических кислот. Оказалось, что их больше всего в грунте (4.2-106 — 4.0-108 КОЕ/г) и на порядок меньше в минеральных образованиях пещеры (в мондмильхе — 1.7-105 — 1.1-107

КОЕ/г и в Pool ngers — 2.3-7.8*10 6 КОЕ/г). Однако бактериальные сообщества из пещерных образований (грунт, мондмильх и «бассейновые пальцы») способны более активно вызывать осаждение карбонатов кальция, чем почвенные.

Нами отмечено, что те или иные бактериальные сообщества предпочитают разные органические кислоты. Так, при посеве сообщества «бассейновых пальцев» на среде с янтарной кислотой у 67 % колоний происходило отложение минеральных фаз, тогда как на яблочной кислоте только у 30 %. А сообщество почвы предпочитает среду с яблочной кислотой: около 66 % колоний микроорганизмов отлагали минеральные фазы. Бактериальные сообщества монд-мильха на среде с уксусной кислотой в 99 % отлагали кристаллы, а при инокуляции почвенных микроорганизмов на той же самой среде кристалли зация шла только у двух колоний из шестидесяти.

Эксперименты показали, что образование кристаллических фаз карбонатов кальция происходит только в аэробных условиях, даже при низких концентрациях источника кальция. Максимум лавинной кристаллизации новообразованных минералов в бактериальном матриксе и вокруг колоний микроорганизмов на средах с органическими кислотами наблюдается после трехнедельного культивирования. Эти новообразования с небольшими различиями в зависимости от типа биоинокулянта представлены кристаллами (рис. 2, а) и микроконкрециями (рис. 2, в, г) карбоната кальция. На рис. 2, г наблюдается последовательное обрастание воронковидных кристаллов биоплёнкой и формирование шаровидных образований.

Эксперимент 2 решал ряд вопросов: меняется ли рН питательной сре ды в процессе культивирования бактерий, зависит ли морфология новообразованных минералов от состава питательной среды и видовой принадлежности штаммов; какие минералы карбоната кальция образуются, имеются ли промежуточные минеральные фазы. Из широко представленного микробного сообщества «бассейновых пальцев» (1.8—4.6*106 КОЕ/г), выросшего на дикарбоновых (яблочная и янтарная) кислотах, были отобраны одиннадцать изолятов бактерий — грамположительных и грамот-рицательных аэробных и факультативно анаэробных палочек и кокков, которые культивировались на питательных средах Variant 3 (измененная) и Gran’s (измененная) (табл. 1).

Для всех штаммов, культивируемых с янтарной кислотой, по результатам измерения рН среды на 21 сутки установлено её защелачивание до 9 при начальном значении рН 7.2.

Рис. 2. Микрофотографии новообразований, полученных в эксперименте 1: а — кристаллы; б — микроконкреции со скорлупова-тым строением; в — последовательное обрастание воронковидных кристаллов биоплёнкой и формирование шаровидных микроконкреций

Fig. 2. SEM images of new formations obtained in Experiment 1: a — crystals; б — micronodules with shelly structure; в — sequential fouling of funnelform crystals by biofilms and formation of globular micronodules

Таблица 1

Характеристики микроорганизмов, выбранные для исследований минеральных отложений эксперимента 2

Characteristics of microorganisms selected for the study of mineral formation at experiment 2

Штаммы изоляты	Питательная среда	Форма клеток	Описание колонии: цвет, размер	Цвет грамма*	Потреби глюкозы	Аэробный рост
1-2а	Variant 3	палочки	бесцв. желт мелкие	+	+	±
1-2Ь	Variant 3	палочки	бесцв. мелкие	-	+	±
1-3	Variant 3	кокки	желтые большие	-		+
1-За	Variant 3	кокки	желтые мелкие	+	+	+
1-4	Variant 3	палочки	бесцв. большие butyrous	-	+	+
1-5	Variant 3	палочки	оранж. мелкие	-	-	+
1-6	Variant 3 +peptone	палочки	бесцв. большие butyrous	-	+	±
2-2	Gran’s medium	палочки	бесцв. большие butyrous	-	-	±
2-5	Gran’s medium	кокки	желтые большие	-	+	±
2-6	Gran’s medium	палочки	бесцв. большие	-	+	+
2-7	Gran’s medium	палочки	бесцв. мелкие	-	+	+

* тесты:«+» — положительный,«—» — отрицательный, «±» — факультативные анаэробы, butyrous — колония маслянистая, жирная; peptone — пептон

Доминирующей формой новообразований можно считать расщеплённые кристаллы, как у изолята 1-2а (рис. 3, а), хотя встречаются и образования специфичного габитуса — агрегаты изолята 1-6 (рис. 3, б) и изолята 1-3 (рис. 3, в). Отчетливого влияния состава питательной среды на морфологию новообразований не наблюдалось. Так, изоляты 1-5 (рис. 3, г), 2-5 (рис. 3, д) и 2-7 (рис. 3, е) отлагают расщеплённые кристаллы идентичного габитуса, хотя изолят 1-5 культивировался на среде Variant 3, а изоляты 2-5 и 2-7 — на среде Gran’s (табл. 1). Находки бактериальных микрофосси-лий в этих однозначно бактериальных карбонатах редки: при увеличениях более Г4300 в кристаллической массе лишь некоторых образований можно увидеть остатки захороненных бактерий (рис. 3, г).

По данным рентгендифракто-метрического анализа установлено, что новообразования всех 11 изолятов представлены кальцитом без промежуточных фаз (табл. 2). Степень ок-ристаллизованности минерала достаточно высока. На дифракционных кривых он характеризуется узкими и интенсивными рефлексами. На диф-рактограммах гелеобразных образцов рентгеноаморфная фаза диагностируется по наличию высокой линии фона и «горбов» (рис. 4, а), на которых наблюдаются отчетливые кальцитовые рефлексы, которые становятся всё более интенсивными по мере высыхания образцов (пробы были получены накануне исследований). Параметры элементарных ячеек, рассчи танные для кальцитов из образцов 11 изолятов (Si-эталон), достаточно близки, хотя и немного различаются по величине (табл. 2).

Следует отметить, что в результате ранее проведённого эксперимента коллег [12] доминирующей минеральной фазой также был получен кальцит. А некоторые кристаллы в экспериментальной системе с бактериями также включали бактериальные отпечатки на поверхностях. Хотя цели наших экспериментов отличаются, равно как и выбранные штаммы и питательные среды, результаты опытов

Таблица 2

Результаты изучения новообразованных карбонатов методом рентгендифрактометрического анализа, эксперимент 2

The results of the study of the newly formed carbonates at the experiment 2

№ n/n	Наименование изолята	Фазовый состав	Параметры элементарных ячеек кальцита
			а, А	с, А
1	l-2a	Кальцит	4.9810(0.0012)	17.03 67 (0.0081)
2	1-26	Кальцит	4.9784 (0.0010)	17.0324 (0.0146)
3	1-3	Кальцит	4.9805 (0.0005)	17.0158 (0.0040)
4	1-4	Кальцит	4.9817(0.0009)	16.9963 (0.0082)
5	1-5	Кальцит
6	1-6	Кальцит	4.9816(0.0007)	17.0237 (0.0103)
7	2-2	Кальцит	4.9763 (0.0012)	17.0529 (0.0201)
8	2-5	Кальцит
9	2-6	Кальцит	4.9800 (0.0007)	17.0086 (0.0052)
10	2-7	Кальцит
11	A	Кальцит	4.9808	17.0295
12	1-6 ЖИДК.	Кальцит, галит	4.9816(0.0009)	16.9952 (0.0075)
13	контроль	Галит

демонстрируют, что осаждение кальцита происходит закономерно при подщелачивании среды в процессе жизнедеятельности бактерий.

Эксперименты 3 и 4 проводились с изолятами 1-2а и 14 соответственно. Бактерии штамма 1-2а оказались наиболее жизнеспособными и продуктивными в лабораторных условиях. А для бактерий штамма 14, выделенных из грунта пещеры Киндерлинская (Башкортостан, Гафурийский р-н), характерно образование большого количества полисахаридов, что способствует осаждению карбонатов. За-

Рис. 3. Кристаллы и агрегаты карбоната кальция, полученные in vitro в эксперименте 2: а — расщеплённые кристаллы, доминирующая форма новообразований (изолят 1-2а); б — образования специфичного габитуса (агрегаты изолята 1-6); в — карбонатные агрегаты нетипичного облика (изолят 1-3); г — остатки бактерий, захороненных в процессе роста кристаллов

Fig. 3. Crystals and aggregates of calcium carbonate obtained in vitro at experiment 2: a — splitted crystals — the dominant form (isolate 1-2a); б — the formation of specific habit (isolate 1-6); в — carbonate aggregates of atypical habit (isolate 1-3); г — the bacterial remains buried in the process of crystal growth

Рис. 4. Результаты изучения методом рентгендифрактометри-ческого анализа биокарбонатов, полученных in vitro в экспериментах 2, 3 и 4 (межплоскостные расстояния приведены в ангстремах): а — дифрактограммы кальцита (эксперимент 2); б — дифрактограммы доминирующей минеральной фазы экспериментов 3 и 4 (низкомагнезиальный кальцит); в — дифрактограммы карбонатных фаз (эксперимент 4); I — в гелеобразном состоянии, II — в воздушно-сухом; С — кальцит, Mg—Ca — низкомагнезиальный кальцит, A — апатит, Ar — арагонит, К — кутногорит, D — доломит

Fig. 4. XRD patterns of biocarbonates obtained in vitro at experiments 2, 3 and 4 (spacing in A): a — calcite XRD pattern (Experiment 2); б — XRD pattern of predominant mineral phase of experiments 3 and 4 (low-magnesium calcite); в — XRD pattern of carbonates (Experiment 4) I — gel state, II — air-dried. C — calcite, Mg—Ca — low-magnesium calcite, A — apatite, Ar — aragonite, K — kutnohorite, D — dolomite дачей этих экспериментов было получение и изучение минеральных новообразований при наличии магния в питательной среде (пептонная вода; Gran’s с изменениями) и марганца (среда Gran’s с изменениями).

Так, оказалось достаточно концентрации MgSG4'7H20 — 0.5 и CaCl2 — 2 г/л (пептонная вода) для формирования агрегатов низкомаг-незиального кальцита. Рассчитанные для него параметры элементарной ячейки (a = 4.9808 A, c = 17.0295 А, V = 365.8806 А3) хорошо согласуются с литературными данными, полученными для биогенных магнезиальных кальцитов с невысоким содержанием Mg [4, 10].

На среде Gran’s с изменениями, при повышении магнезиальности относительно источника кальция (от CaCl2 — 1.65, MgSG4 — 2.42 до CaCl2 — 1.0, MgSG4 — 2.0 г/л) (табл. 3) бактерии отреагировали формированием нескольких фаз низкомагнезиально-го кальцита с различным содержанием магния в структуре. На дифракционных кривых это выражается в уширении кальцитовых рефлексов. При этом явного расщепления отражений не наблюдается, что свидетельствует о незначительной разнице в метрике кристаллической решетки и, соответственно, близком содержании магния в карбонатных фазах. Параметры элементарных ячеек, рассчитанные для Mg-кальцита из разных образцов (Si-эталон), достаточно близки между собой, хотя и значительно меньше, чем эти же характеристики для кальцита.

Вместе с пиками кальцита на дифракционных кривых гелеобразных образцов (I) присутствуют многочисленные слабые и трудноиденти-фицируемые рефлексы, которые обычно исчезают при высыхании проб (II). Можно предположить, что это отражения промежуточных гидро-карбонатных фаз. Кроме низкомагне-зиального кальцита более или менее уверенно можно определить наличие небольшого количества кальциевого магнезита с d/n104 = 2.79 А и магнезиального кальцита (или доломита) с d/n104 = 2.89 А. В частности, на диф-рактограмме изолята 1-2а кроме низ-комагнезиального кальцита отмечается небольшое количество магнезиаль ного кальцита с d/n104 = 2.94 А и магнезита (рис. 4, б). A присутствие ика-ита в гелеобразном образце изолята 14 (табл. 3) объясняется тем, что пробы для исследований замораживались при транспортировке и этот криогенный карбонат мог сформироваться техногенно путём биохемогенного осаждения из ещё не полностью рас-кристаллизованного субстрата.

Наличие источника марганца в составе среды Gran’s с изменениями (CaCl2 — 3.0, MnCl2 — 0.055 г/л) привело к образованию кальцита и арагонита в пробах штамма 14. Бактерии изолята 1-2а в таких же условиях способствовали осаждению кальцита, арагонита, в незначительных количествах кутногорита CaMn [CG3]2и, предположительно, родохрозита (табл. 3). Степень окристал-лизованности минералов достаточно высока, на дифракционных кривых она характеризуется узкими и интенсивными рефлексами (рис. 4, в), тем не менее рентгеноаморфного материала относительно много и в сухих образцах. После прокаливания проб до 600 °С «горб» на дифракто-

Таблица 3

Результаты изучения новообразованных карбонатов методом рентгендифрактометрического анализа, эксперименты 3 и 4

The results of the study of the newly formed carbonates at experiments 3 and 4

№	H « о s	эксперимент 3		эксперимент 4
		среда Gran’s с изменениями (г/л)
		СаС12- 1.65, MgSO4 - 2.42		СаС12-1.0, MgSO4 - 2.0		СаС12 - 3.0, МпС12 - 055
		гель	воздушносухой	гель	воздушно-сухой	гель	воздушно-сухой
1	14	Mg-кальцит	Mg-кальцит	Mg-кальцит (несколько фаз), икаит, апатит (мало)	Mg-кальцит (несколько фаз), апатит (мало)	кальцит, апатит, арагонит(?)	кальцит, апатит
2	l-2a	Mg-кальцит, доломит, Са-магнезит, гидромагнезит(?), магнезит	Mg-кальцит	Mg-кальцит, апатит, доломит(?)	Mg-кальцит, апатит, доломит(?)	Кальцит, апатит, Mg-кутногорит, родохрозит(?)	Кальцит, апатит, Mg-кутногорит, родохрозит(?)
5	^ о о	сильвин,галит		осадка недостаточно		осадка недостаточно

граммах исчезает. Это свидетельствует о раскристаллизации минеральной фазы и образовании уже установленных минералов с устойчивой кристаллической решеткой, тем более что появления каких-либо новых фаз не отмечено, равно как и исчезновения исходных, а при прогреве до 600 °C рефлексы апатита и кальцита становятся более узкими и интенсивными, что подтверждает более высокую степень структурной упорядоченности минералов. Апатит в том или ином количестве присутствует во всех образцах, включая контрольные, и, скорее всего, сформирован хемогенным путем.

Выводы

Подводя итог, можно отметить, что эксперименты по лабораторному осаждению карбонатов подтверждают гипотезу бактериального происхождения природных образований кальцита. Однако следует учитывать, что осаждение биокарбонатов, несмотря на широкое распространение в природе карбонатотлагающих бактерий, происходит в специфичных обстановках. Так, в процессе подбора питательной среды было установлено следующее: на мясном бульоне — возможном источнике углерода — даже при наличии ионов Са2+ и CO2 минеральная фаза не образуется, т. к. щёлочно-кис-лотный баланс сдвигается в сторону кислой среды.

Формирование кристаллов кальцита происходит на среде с органичес- кими дикарбоновыми кислотами (янтарная, яблочная) в аэробных условиях. В процессе жизнедеятельности бактериальные сообщества выделяют щелочи и изменяют рН среды до 8.5, что приводит к выпадению кристаллов. В стерильной среде Gran’s через месяц нахождения в аэробных условиях при комнатной температуре выпадение кристаллов не наблюдается, а рН смещается в кислую сторону от 7.2 изначально до 6.4 в конце эксперимента.

Теория выпадения кристаллов при высыхании из стерильного пересыщенного раствора в данном случае не подтвердилась. Также важно, что источником кальция при формировании биогенного кальцита может являться CaCl2*2H2O в концентрации 3.3 г/л, а не гидрокарбонаты, как ранее предполагалось.

Традиционно расщеплённые кристаллы, в том числе кальцита, считались хемогенными образованиями, однако изучение методом СЭМ выращенных in vitro проб показало, что эта форма доминирует у бактериальных карбонатов.

Для образования монофазы низ-комагнезиального кальцита в питательной среде достаточно концентрации MgSO4-7H20 — 0.5 и CaCl2 — 2 г/л (пептонная вода). При повышении магнезиальности по отношению к кальцию (среда Gran’s, опыт 3,4) происходит образование нескольких дискретных карбонатных фаз с немного отличающимся содержанием магния и, следовательно, различной метрикой кристаллической решетки.

Работа выполнена в рамках проекта «Роль биогенного фактора в процессах формирования тонкодисперсных слоистых силикатов и марганецсодержащих минералов и руд» программы УрО РАН 15-18-5-49.