Ферментативный спектр крови и морфологические характеристики тушек цыплят-бройлеров (Gallus gallus domesticus): сравнительный анализ кроссов Смена 8 и Arbor Acres

Анализ ферментативного профиля сыворотки/плазмы крови стал востребованным инструментом оценки физиологического состояния сельскохозяйственной птицы с конца XX века (1). При этом в рамках подобной энзимодиагностики в современной ветеринарной биохимии принято определение трех групп циркулирующих ферментов. Первая представлена ферментами клеточного метаболизма (трансферазы, дегидрогеназы, фосфатазы и др.), поступающими в кровь из тканей с высокой степенью их экспрессии и характеризующими интенсивность происходящих там специфических обменных процессов (2). Вторая группа включает пищеварительные ферменты (амилазы, липазу и трипсин), поступающие в кровоток напрямую из вырабатывающих их желез или являющихся результатом рециркуляции из просвета кишечника (3). Третья группа состоит из ферментов антиоксидантной системы (супероксиддисмутаза, каталаза и др.), защищающих организм сельскохозяйственной птицы от окислительного стресса (4).

Опыт определения ферментативных параметров и использования полученных данных показал их высокую информативность как факторов, определяющих мясную продуктивность цыплят-бройлеров (5) или яичную продуктивность кур-несушек (6), а также как маркеров эффективности для отработки оптимальных режимов кормления (7) и содержания (8). Вместе с тем сравнительные исследования ферментативных профилей разных кроссов, позволяющие объяснить различия в их продуктивности, пока еще носят единичный характер (9, 10), что не позволяет сформировать целостные представления о связях между анализируемыми биохимическими показателями крови и хозяйственно полезными признаками сельскохозяйственной птицы.

В настоящей работе впервые показано, что более высокие показатели продуктивности цыплят-бройлеров кросса Arbor Acres в сравнении с кроссом Смена 8 могут быть обусловлены высокой активностью ферментов энергетического и пластического метаболизма при минимальной значимости ферментов антиоксидантной защиты, в то время как различия внутри кроссов ассоциированы с активностью некоторых метаболических и пищеварительных ферментов.

Нашей целью стал анализ основных метаболических, пищеварительных и антиоксидантных ферментов сыворотки крови, а также морфологических характеристик цыплят-бройлеров кроссов Смена 8 и Arbor Acres с определением наиболее значимых ассоциаций между биохимическими и производственными параметрами.

Методика. Работа была выполнена в формате мета-анализа, интегрирующего результаты нескольких серий однотипных экспериментов, и направлена на выявление причинно-следственных взаимосвязей, остающихся неидентифицированными в рамках одного отдельного оригинального исследования с ограниченным числом наблюдений (11).

В мета-анализ были включены эксперименты, проведенные в 20162024 годах на базе вивария и Центра коллективного пользования БСТ РАН . При проведении экспериментов авторы старались стандартизовать их условия, что заключалось как в максимально возможной унификации базовых рационов кормления (приобретение идентичных кормов у одного и того же поставщика), так и в использовании идентичных диагностических тест-систем и оборудования для исследования ферментативной активности сыворотки крови.

Объектами изучения были цыплята-бройлеры ( Gallus gallus domesticus ) мясных кроссов Смена 8 (СГЦ «Смена» — филиал ФГБНУ ФНЦ «ВНИ-ТИП» РАН, Россия) и Arbor Acres (ООО «Авиаген», Россия), выращенные до возраста 42 сут. Для мета-анализа использовали данные, полученные для 12 групп кросса Смена 8 и 28 групп кросса Arbor Acres численностью 1530 гол. каждая.

Содержание птицы осуществлялось в соответствии с нормативами, оговоренными в Модельном законе Межпарламентской Ассамблеи государств-участников Содружества Независимых Государств «Об обращении с животными», ст. 20, № 29-17 от 31.10.2007 года. При выполнении исследований были предприняты меры для сведения к минимуму страданий животных и уменьшения числа исследуемых образцов.

Птицу содержали в групповых клетках (4050 см²), в помещении с контролируемыми температурой (26-28 ° С — со 2 по 4 нед, 20-22 ° С — с 5 по 7 нед) и влажностью (65-70 %), со свободным доступом к корму и воде.

Птица 8 контрольных групп получала только двухфазный базовый рацион, рекомендуемый Всероссийским научно-исследовательским и технологическим институтом птицеводства (12). В свою очередь, рационы птицы 9 экспериментальных групп кросса Смена 8 и 23 групп кросса Arbor Acres включали пробиотические добавки на основе Bacillus cereus IP 5832 («Laboratoires AVENTIS», Франция) или Bifidobacterium adolescentis / Lactobacillus acidophilus (ООО Биотехнологическая фирма «Компонент», Россия) (13, 14), антибиотик хлортетрациклин (ООО ПО «Сиббиофарм», Россия) (15), цельный растительный экстракт коры дуба Quercus cortex (14, 15), а также химически синтезированные аналоги малых молекул растительного происхождения: гамма-лактон, производное кумарина, ванилин/ванилино-вую кислоту, гексилрезорцинол и кверцетин с чистотой 95-98 % («Acros Organics B.V.B.A.», Бельгия) (13, 16, 17). При этом эффекты разных кормовых добавок в настоящем исследовании непосредственно не анализировали, но они служили фоном для обнаружения принципиальных зависимостей «ферменты крови — продуктивность», не выявляемых в рамках отдельной экспериментальной серии.

По окончании экспериментов из каждой контрольной и опытной группы случайным образом были отобраны по 10 птиц, у которых прижизненно из подкрыльцовой вены получали образцы крови для биохимического анализа. Кровь помещали в вакуумные пробирки с коагулянтом — активатором свертывания («Zhejiang Gongdong Medical Technology Co., Ltd.», Китай), после чего сыворотку крови отделяли при 1500 об/мин с использованием центрифуги LMC-4200R («BioSan», Латвия).

Активность метаболических и пищеварительных ферментов определяли на автоматическом анализаторе CS-T240 («DIRUI Industrial Co., Ltd», Китай). Активность аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатамино -трансферазы (АсАТ), гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), щелочной фосфатазы (ЩФ), альфа-амилазы, панкреатической амилазы и липазы исследовали с использованием коммерческих наборов для ветеринарии ДиаВетТест (ООО «ДИАКОН-ДС», Россия). Активность супероксиддисмутазы (СОД) количественно оценивали на биохимическом анализаторе Stat Fax 1904 Plus («Awareness Technology, Inc.», США) с помощью наборов реагентов производства «Randox Laboratories Ltd.» (Великобритания), активность каталазы определяли в тесте с молибдатом аммония (18).

После взятия крови для оценки предубойной живой массы птицу взвешивали на прецизионных электронных весах и гуманно забивали с последующей анатомической разделкой тушек (19). Определяли массу полу-потрошеной и потрошеной тушки; массу грудных, бедренных и других мышц; массу внутренних органов (печень, селезенка, почки); массу костей. Дополнительно рассчитывали убойный выход, массу съедобной и несъедобной частей тушки, а также их соотношение.

Численные данные обрабатывали с использованием программного пакета Statistica 8.0 («StatSoft, Inc.», США). Сравнительные значения для кроссов Смена 8 и Arbor Acres оценивали с использованием модуля «непараметрическая статистика» и представляли в формате медианных [Q1-Q3] значений. Интегральную сравнительную оценку ферментативных профилей проводили с помощью модуля «факторный анализ» (метод главных компонент). Соответствия между биохимическими маркерами и параметрами продуктивности были проанализированы с использованием модуля «корреляционный анализ». Учитываемые пороги анализируемых величин были установлены на уровнях p < 0,05; p < 0,01 и p < 0,001.

Результаты. Сравнение результатов биохимического анализа крови у цыплят-бройлеров кроссов Смена 8 и Arbor Acres свидетельствовало о статистически значимых различиях активности 6 из 10 исследуемых ферментов (табл. 1), в то время как в отношении АсАТ, панкреатической амилазы, липазы и каталазы рассчитанные значения p-критерия не позволяли отклонить нулевую гипотезу.

1. Активность ферментов сыворотки крови у цыплят-бройлеров ( Gallus gallus domesticus ) мясных кроссов Смена 8 и Arbor Acres (виварий и Центр коллективного пользования БСТ РАН, 2016-2024 годы)

Показатель	Смена 8		Arbor Acres		p
	Me	Q1-Q3	Me	Q1-Q3
Ферменты клеточного мета			б о л и з м а
Аланинаминотрансфераза, Ед/л	4,28	3,90-4,52	17,37	14,65-19,99	0,002
Аспартатаминотрансфераза, Ед/л	240,92	228,83-252,26	368,32	97,37-425,23	> 0,05
Гамма-глутамилтрансфераза, Ед/л	16,50	15,50-18,42	20,77	20,00-24,33	0,005
Лактатдегидрогеназа, Ед/л	1287,50	1150,00-1425,00	1989,67	1887,33-2128,84	0,002
Щелочная фосфотаза, Ед/л	1790,00	1685,00-1826,00	1752,30	1589,00-1963,84	0,019
Пищеварительные ферменты
Альфа-амилаза, Ед/л	60,84	58,17-63,17	67,29	44,33-78,20	> 0,05
Панкреатическая амилаза, Ед/л	356,44	347,22-408,04	359,17	333,63-414,87	> 0,05
Липаза, Ед/л	6,60	5,91-7,82	6,68	6,04-8,21	> 0,05
Ферменты антиоксидантной			защиты
Супероксиддисмутаза, %	44,66	40,91-46,15	43,24	39,75-56,44	0,006
Каталаза, мкмоль Н 2 О 2 /Л • мин	54,08	45,97-58,78	59,60	57,08-62,58	> 0,05

Наиболее выраженные различия (р = 0,002) были зафиксированы для двух ферментов клеточного метаболизма, АлАТ и ЛДТ, медианные величины активности которых в сыворотке крови цыплят-бройлеров Arbor Acres превышали аналогичные значения у кросса Смена 8 соответственно в 3,92 и 1,53 раза. При этом первый из ферментов играет важную роль в синтезе и катаболизме аминокислот (реакция трансаминирования/переамини-рования), что позволяет рассматривать его как маркер интенсивности белкового обмена (20), а второй, катализирующий обратимое превращение пирувата в L-лактат в процессе гликолиза (21), предложен к использованию в качестве дополнительного индикатора мясной продуктивности сельскохо- зяйственной птицы (5).

Статистически значимо (р = 0,005) повышалось у цыплят-бройлеров Arbor Acres и содержание ГГТ, которая также участвует в обмене аминокислот (22), но проявляет определенную органоспецифичность: фермент присутствует в клетках печени, почек и поджелудочной железы, но не обнаруживается в скелетных мышцах и миокарде) (23).

В противоположность этому сыворотка крови цыплят-бройлеров кросса Смена 8 обладала повышенной активностью ЩФ (р = 0,019), осуществляющей гидролиз многих фосфорных эфиров и служащей чувствительным индикатором развития костной ткани у сельскохозяйственной птицы (24).

В свою очередь, при исследовании активности ферментов антиоксидантной защиты на фоне близости медиан, но при существенной вариации результативных значений, статистически значимые (р = 0,006) различия между сравниваемыми кроссами были установлены по СОД, защищающей клетки от повреждающего действия супероксид-аниона посредством его дисмутации в перекись водорода (25). При этом в совокупности с тенденцией к повышению активности каталазы полученные результаты свидетельствуют о несколько более выраженном напряжении системы обезвреживания активных форм кислорода у цыплят-бройлеров кросса Arbor Acres, которая защищает их от токсического действия свободных радикалов, образующихся в результате нарушения кормовых, технологических или иных условий выращивания, что способно негативно отразиться на состоянии здоровья, показателях роста и качестве продукции мясного птицеводства.

В целом, полученные результаты свидетельствовали о принципиальном различии ферментативных профилей сыворотки крови цыплят-бройлеров кроссов Смена 8 и Arbor Acres, что стало основанием для их интегральной оценки с использованием многопараметрического статистического анализа — метода главных компонент.

Учет интеркоррелированных количественных данных биохимического исследования позволил идентифицировать ортогональные переменные (факторы), первый из которых — Ф1 (собственное значение 2,592; объясненная дисперсия 25,92 %) характеризовался наибольшими варимакс-нормализированными факторными нагрузками (ФН) для двух метаболических ферментов: АлАТ (ФН = 0,910) и ЛДГ (ФН = 0,926). Кроме того, над нижней границей значимости в структуре Ф1 присутствовал еще один метаболический фермент — ГГТ (ФН = 0,718). В свою очередь, второй идентифицированный фактор — Ф2 (собственное значение 1,989; объясненная дисперсия 19,89 %) имел наибольшие факторные нагрузки по двум пищеварительным ферментам — альфа-амилазе (ФН = 0,813) и липазе (ФН = 0,879).

Последующее позиционирование исследуемых групп в координатном пространстве Ф1 х Ф2 позволило четко зафиксировать характер различий ферментативных профилей сыворотки крови цыплят-бройлеров кроссов Смена 8 и Arbor Acres (рис. 1). При этом фактор Ф1, описывающий активность метаболических ферментов, показал высокую дифференцирующую активность между сравниваемыми кроссами: в матрице величин, фиксирующей степень связи отдельных переменных с фактором Ф1, группы Arbor Acres приобретали преимущественно положительные (от +1,237 до -0,314), а Смена 8 — исключительно отрицательные значения. В свою очередь, фактор Ф2, описывающий активность пищеварительных ферментов, уже не столь однозначно ассоциировался с определенным кроссом, но содержательно дополнял представления о распределении характерных для них профилей ферментативной активности, в том числе существенно варьиру- ющих у кросса Arbor Acres.

Рис. 1. Диаграмма рассеяния, характеризующая различия в ферментативных профилях сыворотки крови цыплят-бройлеров ( Gallus gallus domesticus ) мясных кроссов Смена 8 (черные кружки) и Arbor Acres (белые кружки) в системе координат факторов Ф1 — метаболические ферменты и Ф2 — пищеварительные ферменты (виварий и Центр коллективного пользования БСТ РАН, 2016-2024 годы) .

Сравнение морфологических параметров тушек цыплят-бройлеров кроссов Смена 8 и Arbor Acres, в том числе включающих количественные показатели их мясной продуктивности, также позволило зафиксировать существование множественных существенных различий (табл. 2).

2. Морфологические параметры цыплят-бройлеров (Gallus gallus domesticus) мясных кроссов Смена 8 и Arbor Acres, определенные в возрасте 42 сут (виварий и Центр коллективного пользования БСТ РАН, 2016-2024 годы)

Показатель Смена 8 Arbor Acres р Me Q1-Q3 Me Q1-Q3 Предубойная живая масса, г 2321,40 2217,10-2448,50 2894,67 2713,84-3170,75 0,002 Масса полупотрошеной тушки, г 1999,60 1877,85-2053,00 2440,46 2303,11-2713,53 0,002 Масса потрошеной тушки, г 1551,60 1467,00-1595,50 1891,06 1812,20-2107,98 0,002 Убойный выход, % 66,34 65,58-67,54 66,34 65,99-67,54 > 0,05 Мышечная ткань, г 1023,50 962,45-1038,10 1222,61 1175,85-1351,43 0,002 Костная ткань, г 448,60 410,40-487,00 563,55 500,62-599,31 0,003 Масса печени, г 40,24 40,17-41,82 53,81 50,50-60,20 0,002 Масса почек, г 15,55 14,16-17,58 18,81 17,99-21,27 0,003 Масса селезенки, г 2,79 2,39-2,82 3,16 3,01-3,51 0,019 Масса съедобных частей тушки, г 1618,65 1564,80-1713,90 2027,14 1897,42-2225,57 0,002 Масса несъедобных частей тушки, г 645,45 599,25-699,90 807,85 727,15-850,23 0,003 Отношение съедобных частей тушки 2,49 2,45-2,71 2,49 2,45-2,76 > 0,05 к несъедобным

На высоком уровне статистической значимости (р = 0,002) показатели предубойной живой массы, массы полупотрошеной и потрошеной тушек цыплят-бройлеров кросса Arbor Acres превышали таковые у кросса Смена 8. Кроме того, при последующей разделке тушек кросс Arbor Acres показал значимое превышение абсолютных значений массы как мышечной (р = 0,002), так и костной ткани (р = 0,003), массы печени (р = 0,002), почек (р = 0,003). На несколько меньшем уровне статистической значимости (р = 0,019) была массы селезенки. Как результат, наблюдалось существенное превышение массы как съедобной (р = 0,002), так и несъедобной (р = 0,003) частей тушек у цыплят-бройлеров кросса Arbor Acres в сравнении с кроссом Смена 8.

В то же время на фоне указанных различий между абсолютными весовыми характеристиками тушек цыплят-бройлеров статистически значимые различия по вычисляемым на их основе относительным показателям продуктивности (убойный выход, отношение съедобных частей тушки к несъедобным) между кроссами Смена 8 и Arbor Acres отсутствовали.

Полученные данные развивают представления о мясных качествах бройлеров отечественной и зарубежной селекции (26), в том числе зависимости показателей живой массы, индекса продуктивности и убойного выхода от их генотипа (27). При этом результаты настоящего исследования хорошо согласуются с представлениями о высокой продуктивности глобально распространенного кросса Arbor Acres (28), тогда как бройлеры российского кросса Смена по величине живой массы и затратам корма на прирост ранее несколько уступали кроссам Ross 308 и Cobb 500 (29).

Для выявления причинно-следственных взаимосвязей в парах фермент-продуктивность на следующем этапе исследования был выполнен корреляционный анализ, ассоциирующий активность отдельных ферментов крови с морфологическими параметрами тушек цыплят-бройлеров, проведенный в трех вариантах: для всех групп, для групп кросса Смена 8, для групп кросса Arbor Acres.

ГГТ. Ед/л

Рис. 2. Корреляционные зависимости, связывающие активность метаболических ферментов лактатдегидрогеназы (А) , аланинаминотрансферазы (Б) и гамма-глутамилтрансферазы (В) с морфологическими параметрами тушек цыплят-бройлеров ( Gallus gallus domesticus ) мясных кроссов Смена 8 (черные кружки) и Arbor Acres (белые кружки) (виварий и Центр коллективного пользования БСТ РАН, 2016-2024 годы) .

Интегральный анализ показал, что большинство определяемых параметров продуктивности (предубойная живая масса, масса полупотрошеной и потрошеной тушки, масса мышечной ткани, костной ткани, печени и почек) со средней силой положительно ассоциировались с активностью трех метаболических ферментов: ЛДГ, АлАТ и ГГТ. При этом для каждого из них наибольшие номинальные значения коэффициентов корреляции были найдены в парах ЛДГ—предубойная живая масса (r = 0,699; p < 0,001), АлАТ—масса съедобной части тушки (r = 0,588; p < 0,001) и ГГТ—масса печени (r = 0,586; p < 0,001) (рис. 2).

Значимость метаболических ферментов дополнялась активностью АсАТ, на нижнем уровне статистической достоверности прямо ассоциированной с параметрами предубойной живой массы ( r = 0,318, p = 0,045), массой полупотрошеной ( r = 0,315, p = 0,047) и потрошеной тушки ( r = 0,318, p = 0,045), а также массой ее съедобной части ( r = 0,314, p = 0,048).

Еще одним ферментом крови, показавшим свое значение при интегральном анализе, была каталаза, слабо положительно коррелирующая с предубойной массой, массой полупотрошеной и потрошеной тушки, массой мышечной ткани, печени и съедобной части тушки ( r — от 0,322 до 0,373, p — от 0,043 до 0,018).

Таким образом, полученные данные позволяют преимущественно связать различия в продуктивности кроссов Смена 8 и Arbor Acres с генетически детерминированными различиями в активности ферментов энергетического и пластического метаболизма при минимальной значимости ферментов антиоксидантной защиты, потенциально модулируемых при воздействии внешних факторов.

Проведение корреляционного анализа исключительно внутри кросса Смена 8 подтвердило значимость метаболических ферментов. Сильная положительная связь была установлена в парах ГГТ—масса мышечной ткани ( r = 0,726, p = 0,008) и ГГТ—масса селезенки ( r = 0,757, p = 0,004), что сопровождалось ассоциированностью ГГТ с показателем убойного выхода ( r = 0,607, p = 0,036). В свою очередь, положительные коэффициенты корреляции среднего уровня значимости связывали активность ЛДГ с массой костной ткани и почек ( r — от 0,628 до 0,661; p — от 0,029 до 0,019), что результировалось в формировании отрицательной взаимосвязи с параметром, оценивающим соотношение массы съедобной и несъедобной частей тушки ( r = - 0,630, p = 0,028). Тот же параметр продуктивности был положительно ассоциирован с активностью АсАТ ( r = 0,590, p = 0,044). При этом в качестве условия для проявления значимости названных выше метаболических ферментов в выборке для кросса Смена 8 следует назвать варьирование их активности в отдельных группах, потенциально объясняемое генетическим разнообразием исходных линий (отечественная Смена 7 и Ross 308 английской селекции), использованных для создания этого мясного кросса бройлерного типа (30).

В свою очередь, аналогичный анализ исключительно внутри кросса Arbor Acres позволил зафиксировать статистически значимые взаимосвязи параметров продуктивности только с пищеварительным ферментом альфа-амилазой. Интересно, что рассчитанные коэффициенты корреляции, ассоциирующие его активность с предубойной живой массой, массой полупотрошеной и потрошеной тушки, массой мышечной ткани, печени и почек, а также съедобной и несъедобной частей тушки приобретали отрицательные значения ( r — от - 0,3 81 до - 0,515, p — от 0,046 до 0,005). Возможным объяснением этого парадокса может быть обратная зависимость активности амилаз d крови цыплят-бройлеров по сравнению с таковой в кишечнике (31), соответствующая гипотезе о циркуляции/рекреции пищеварительных ферментов.

Обсуждая ограничение проведенного мета-анализа следует указать на некоторую недооценку фактора кормления, безусловно, способного оказать воздействие на ферментативный профиль крови цыплят-бройлеров, особенно активность пищеварительных ферментов (32, 33) и (в меньшей степени) ферментов антиоксидантной защиты (34, 35). Решение этой задачи планируется нами при проведении следующей серии мета-анализа, акцентированной на выборе оптимальных кормовых добавок для повышения продуктивности мясного птицеводства

Итак, множественные различия между кроссами Смена 8 и Arbor Acres преимущественно определяются активностью ряда метаболических ферментов (ЛДГ, АлАТ, АсАТ, ГГТ), за счет которой обеспечивается высокая активность энергетического и пластического метаболизма и, соответственно, повышенная продуктивность кросса Arbor Acres. В свою очередь, для поголовья кросса Смена 8 названные генетически детерминируемые ферменты могут быть рекомендованы в качестве дополнительных параметров оценки исходных линий, родителей и финального бройлера при дальнейшей селекции. Дополнительный аспект проведенного исследования заключается в подтверждении значимости пищеварительных ферментов, активность которых в кишечнике и крови цыплят-бройлеров может модулироваться кормовыми добавками и позитивно сказываться на показателях продуктивности внутри определенного кросса. При этом для поголовья Arbor Acres наиболее перспективным представляется добавление в рацион амилолитических ферментов, улучшающих расщепление крахмала и конверсию богатого им трудноперевариваемого растительного корма. В целом, сочетание методов селекции, направленных на интенсификацию метаболических процессов в тканях цыплят-бройлеров, а также технологий кормления, обеспечивающих эффективную конверсию корма в кишечнике птицы, видятся двумя взаимодополняющими подходами к повышению продуктивности современного мясного птицеводства.

1 ФГБНУ ФНЦ биологических систем и агротехнологий РАН,