Модифицированная методика обнаружения антибиотиков в продуктах животноводства методом жидкостной хроматографии
Автор: Копейкина А.А., Мальцев М.В.
Журнал: Природные системы и ресурсы @ns-jvolsu
Рубрика: Биоинженерия и биотехнология
Статья в выпуске: 3 т.15, 2025 года.
Бесплатный доступ
В рамках проведенного исследования была поставлена задача совершенствования методов контроля остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой группы в пищевых продуктах, а именно – мясе птицы. Актуальность данной работы обусловлена необходимостью обеспечения безопасности потребителей и соблюдения нормативных требований по содержанию антибиотиков в пищевой продукции. Для достижения поставленных целей была разработана новая методика анализа, которая включает модификацию условий хроматографического разделения. В частности, были проведены эксперименты по оптимизации параметров высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), таких как выбор мобильной фазы, градиентное изменение состава растворителя, температура колонны и скорость потока. Эти изменения позволили значительно улучшить разделение компонентов, повысить чувствительность и селективность метода. Особое внимание уделялось использованию тандемной масс-спектрометрии (МС/МС), которая обеспечивает высокую точность идентификации и количественного определения антибиотиков даже при их очень низких концентрациях. В результате были получены условия, позволяющие одновременно определять несколько видов тетрациклиновых антибиотиков с высокой точностью и воспроизводимостью. Проведенные испытания показали, что новая методика обладает рядом преимуществ, она обеспечивает более низкий лимит обнаружения, повышенную селективность за счет улучшенного разделения компонентов, а также сокращает время анализа. Это делает ее более эффективной для практического применения в лабораторных условиях. Для подтверждения эффективности новой методики были выполнены сравнительные исследования на реальных образцах пищевой продукции. Результаты показали хорошую корреляцию .В целом, представленная разработка демонстрирует возможность повышения точности и надежности контроля за остатками антибиотиков тетрациклиновой группы в пищевых продуктах за счет использования усовершенствованных условий ВЭЖХ-МС/МС. Внедрение данной методики в практику позволит повысить уровень безопасности пищевой продукции, своевременно выявлять превышения допустимых норм и обеспечивать защиту здоровья потребителей.
Антибиотики, жидкостная хроматография, сельское хозяйство, животноводство, тетрациклиновая группа
Короткий адрес: https://sciup.org/149149850
IDR: 149149850 | УДК: 574.2(470.45) | DOI: 10.15688/nsr.jvolsu.2025.3.5
Modified Method for Detection of Antibiotics in Animal Products by Liquid Chromatography
The study aimed to improve methods for monitoring residual amounts of tetracycline antibiotics in food products, namely poultry meat. The relevance of this work is due to the need to ensure consumer safety and compliance with regulatory requirements for the content of antibiotics in food products. To achieve these goals, a new analysis technique was developed that includes modification of chromatographic separation conditions. In particular, experiments were conducted to optimize the parameters of high-performance liquid chromatography (HPLC), such as the choice of mobile phase, gradient change in solvent composition, column temperature and flow rate. These changes significantly improved the separation of components, increased sensitivity and selectivity of the method. Particular attention was paid to the use of tandem mass spectrometry (MS/MS), which provides high accuracy of identification and quantitative determination of antibiotics even at very low concentrations. As a result, conditions were obtained that allow simultaneous determination of several types of tetracycline antibiotics with high accuracy and reproducibility. The tests showed that the new method has a number of advantages: it provides a lower detection limit, increased selectivity due to improved separation of components, and reduces the analysis time. This makes it more effective for practical use in laboratory conditions. To confirm the effectiveness of the new method, comparative studies were performed on real samples of food products. The results showed a good correlation. In general, the presented development demonstrates the possibility of increasing the accuracy and reliability of monitoring the residues of tetracycline antibiotics in food products due to the use of improved HPLC-MS/MS conditions. The introduction of this method into practice will improve the level of food safety, promptly identify excesses of permissible standards and ensure the protection of consumer health on.
Текст научной статьи Модифицированная методика обнаружения антибиотиков в продуктах животноводства методом жидкостной хроматографии
DOI:
Антибиотики как класс веществ играют ключевую роль в медицине и ветеринарии, обеспечивая эффективное лечение инфекционных заболеваний. Их применение в различных областях сельского хозяйства, и конкретно в животноводстве, имеет как положительные, так и отрицательные стороны [2; 16; 20]. В животноводстве применяются хлорамфеникол, антибиотики тетрациклиновой группы и пенициллин, которые включены в список разрешенных препаратов, регулируемый законодательством [12; 14; 16; 20; 23]. В 2020 году мировое потребление антибиотиков в животноводстве составило 160 тыс. т, и ожидается, что эта цифра может вырасти до 200 тыс. т к 2030 году [25]. Основная часть препаратов является составной частью кормов и применяется не только для лечения, но и для профилактики заболеваний, а также в качестве стимуляторов роста [1; 3; 5; 6; 8; 13; 21; 22; 24; 25]. Но использование антибиотиков может не только улучшать приросты массы животных, практически гарантированным побочным эффектом является изменение микрофлоры кишечника, что потенциально способствует развитию устойчивых штаммов бактерий [7; 15]. Несмотря на то, что значительная часть антибиотиков, находящихся в составе кормов, принятых животными, выводится с мочой и калом (40–90 %), оставшаяся часть накапливается в организме и попадает в продукты животноводства, такие как мясо, молоко и яйца. Таким образом, антибиотики, используемые в животноводстве, гарантированно влияют на организм потребителя – человека [4; 9–11; 13; 17–19; 23]. Поэтому строгий контроль за использованием антибиотиков в животноводстве становится одной из приоритетных задач для государственных надзорных органов.
Материалы и методы исследования
Общепринятым методом обнаружения в продуктах животноводства антибиотиков тетрациклиновой группы является жидкостный хроматографический анализ по: ГОСТ 31694-2012 Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором.
Хроматографический анализ тетрациклинов в пищевой продукции проводили на жидкостном хроматографе с тройным квадрупольным масс-анализатором и линейной ионной ловушкой QTRAP 6500+.
Условия работы жидкостного хроматографа:
-
– температура термостата колонки – 40 оС;
-
– скорость потока элюента – 0,4 мл/мин;
-
– объем вводимой пробы – 10 мкл;
-
– элюент А – подкисленная вода 0,1 %;
-
– элюент В – подкисленный ацетонитрил 0,1 %;
-
– разделение проводить в режиме градиентного элюирования по схеме, градиентного элюирования (табл. 1).
Градуировочную кривую строили при помощи матричной градуировки. Для этого приготовили по 5 заведомо «чистых» проб соответствующих выбранных матриц (мясо птицы) и заражали по схеме, представленной в таблице внесения концентраций градуировочных растворов (табл. 2).
Пробоподготовку провели в двух вариантах, по ГОСТ 31694-2012 и модифицированной методике исключающей этап твердофазной экстракции (ТФЭ). Обычно она применяется для дополнительной очистки экстрактов и предварительного концентрирования тетрациклиновых антибиотиков.
Образец (мясо птицы) экстрагируется с использованием этилацетата. Это позволяет извлечь тетрациклины из матрицы образца. Тетрациклины переходят в органическую фазу (этилацетат), в то время как нежелательные компоненты останутся в водной фазе.
Результаты и обсуждения
Результат сравнения степени извлечения тетрациклинов по ГОСТу и в модифицированной методики приведен на диаграмме (см. рисунок).
Таблица 1
Схема градиентного элюирования
|
Время (мин) |
Поток (мкл/мин) |
Элюент А, % |
Элюент В, % |
|
0,00 |
400 |
90 |
10 |
|
0,10 |
400 |
90 |
10 |
|
3,00 |
400 |
50 |
50 |
|
3,50 |
400 |
50 |
50 |
|
3,60 |
400 |
90 |
10 |
|
6,00 |
400 |
90 |
10 |
Таблица 2
Схема внесения в пробу концентраций градуировочных растворов
|
Характеристика раствора |
Уровни концентраций градуировочных растворов |
||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
|
Объем рабочего раствора № 1 с массовой концентрацией 1 000 нг/см3, мм3 |
10 |
50 |
100 |
||
|
Объем промежуточного рабочего раствора № 2 с массовой концентрацией 100 нг/см3, мм3 |
10 |
50 |
|||
|
Объем рабочего раствора внутреннего стандарта с массовой концентрацией 1 000 нг/см3, мм3 |
50 |
||||
|
Массовая концентрация внутреннего стандарта в полученном градуировочном растворе, нг/см3 |
50 |
||||
|
Массовая концентрация аналитов в полученном градуировочном растворе, нг/см3 |
1 |
5 |
10 |
50 |
100 |
■ Доксициклин
■ Хлортетрацикл ин
■ Окситетрациклин
■ Тетрациклин
Сравнение степени извлечения тетрациклинов по ГОСТ и по модифицированной методике
Степень извлечения по модифицированной методике составляет более 50 %, что является основанием для использования данной методики в пробоподготовке для определения исследуемых соединений. ПДК для тетрациклиновой группы по Техническому регламенту Таможенного союза ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» составляет: не допускается (<0,01 мг/кг); для доксициклина – 0,1 мг/кг [19].
Исследуемые пробы мяса птицы по ГОСТ 31694-2012 и по модифицированной методике не превышают ПДК, то есть отрицательны; аналиты видны четко при низкой концентрации 1 нг.
Заключение
Остатки антибиотиков в пищевых продуктах представляют серьезную проблему, несмотря на критическую необходимость в поддержании биологических объектов животноводства. Эта характеристика продукции животноводства является одним из приоритетных показателей при оценке безопасности. Анализ и модификация традиционных методов контроля за остаточным содержанием антибиотиков необходимы в условиях возросшей нагрузки на надзорные структуры, оценивающие безопасность продуктов питания.
Исключение из процесса пробоподго-товки образцов для определения антибиотиков тетрациклиновой группы этапа твердофазной экстракции (ТФЭ) позволяет значительно сократить продолжительность, трудоемкость метода, а также снизить его стоимость без потери качества проводимого исследования, не выходя за рамки Технического регламента [22].
