Модифицированная методика обнаружения антибиотиков в продуктах животноводства методом жидкостной хроматографии

DOI:

Антибиотики как класс веществ играют ключевую роль в медицине и ветеринарии, обеспечивая эффективное лечение инфекционных заболеваний. Их применение в различных областях сельского хозяйства, и конкретно в животноводстве, имеет как положительные, так и отрицательные стороны [2; 16; 20]. В животноводстве применяются хлорамфеникол, антибиотики тетрациклиновой группы и пенициллин, которые включены в список разрешенных препаратов, регулируемый законодательством [12; 14; 16; 20; 23]. В 2020 году мировое потребление антибиотиков в животноводстве составило 160 тыс. т, и ожидается, что эта цифра может вырасти до 200 тыс. т к 2030 году [25]. Основная часть препаратов является составной частью кормов и применяется не только для лечения, но и для профилактики заболеваний, а также в качестве стимуляторов роста [1; 3; 5; 6; 8; 13; 21; 22; 24; 25]. Но использование антибиотиков может не только улучшать приросты массы животных, практически гарантированным побочным эффектом является изменение микрофлоры кишечника, что потенциально способствует развитию устойчивых штаммов бактерий [7; 15]. Несмотря на то, что значительная часть антибиотиков, находящихся в составе кормов, принятых животными, выводится с мочой и калом (40–90 %), оставшаяся часть накапливается в организме и попадает в продукты животноводства, такие как мясо, молоко и яйца. Таким образом, антибиотики, используемые в животноводстве, гарантированно влияют на организм потребителя – человека [4; 9–11; 13; 17–19; 23]. Поэтому строгий контроль за использованием антибиотиков в животноводстве становится одной из приоритетных задач для государственных надзорных органов.

Материалы и методы исследования

Общепринятым методом обнаружения в продуктах животноводства антибиотиков тетрациклиновой группы является жидкостный хроматографический анализ по: ГОСТ 31694-2012 Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором.

Хроматографический анализ тетрациклинов в пищевой продукции проводили на жидкостном хроматографе с тройным квадрупольным масс-анализатором и линейной ионной ловушкой QTRAP 6500+.

Условия работы жидкостного хроматографа:

• –    температура термостата колонки – 40 ^оС;

• –    скорость потока элюента – 0,4 мл/мин;

• –    объем вводимой пробы – 10 мкл;

• –    элюент А – подкисленная вода 0,1 %;

• –    элюент В – подкисленный ацетонитрил 0,1 %;

• –    разделение проводить в режиме градиентного элюирования по схеме, градиентного элюирования (табл. 1).

Градуировочную кривую строили при помощи матричной градуировки. Для этого приготовили по 5 заведомо «чистых» проб соответствующих выбранных матриц (мясо птицы) и заражали по схеме, представленной в таблице внесения концентраций градуировочных растворов (табл. 2).

Пробоподготовку провели в двух вариантах, по ГОСТ 31694-2012 и модифицированной методике исключающей этап твердофазной экстракции (ТФЭ). Обычно она применяется для дополнительной очистки экстрактов и предварительного концентрирования тетрациклиновых антибиотиков.

Образец (мясо птицы) экстрагируется с использованием этилацетата. Это позволяет извлечь тетрациклины из матрицы образца. Тетрациклины переходят в органическую фазу (этилацетат), в то время как нежелательные компоненты останутся в водной фазе.

Результаты и обсуждения

Результат сравнения степени извлечения тетрациклинов по ГОСТу и в модифицированной методики приведен на диаграмме (см. рисунок).

Таблица 1

Схема градиентного элюирования

Время (мин)	Поток (мкл/мин)	Элюент А, %	Элюент В, %
0,00	400	90	10
0,10	400	90	10
3,00	400	50	50
3,50	400	50	50
3,60	400	90	10
6,00	400	90	10

Таблица 2

Схема внесения в пробу концентраций градуировочных растворов

Характеристика раствора	Уровни концентраций градуировочных растворов
	1	2	3	4	5
Объем рабочего раствора № 1 с массовой концентрацией 1 000 нг/см3, мм3			10	50	100
Объем промежуточного рабочего раствора № 2 с массовой концентрацией 100 нг/см3, мм3	10	50
Объем рабочего раствора внутреннего стандарта с массовой концентрацией 1 000 нг/см3, мм3	50
Массовая концентрация внутреннего стандарта в полученном градуировочном растворе, нг/см3	50
Массовая концентрация аналитов в полученном градуировочном растворе, нг/см3	1	5	10	50	100

■ Доксициклин

■ Хлортетрацикл ин

■ Окситетрациклин

■ Тетрациклин

Сравнение степени извлечения тетрациклинов по ГОСТ и по модифицированной методике

Степень извлечения по модифицированной методике составляет более 50 %, что является основанием для использования данной методики в пробоподготовке для определения исследуемых соединений. ПДК для тетрациклиновой группы по Техническому регламенту Таможенного союза ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» составляет: не допускается (<0,01 мг/кг); для доксициклина – 0,1 мг/кг [19].

Исследуемые пробы мяса птицы по ГОСТ 31694-2012 и по модифицированной методике не превышают ПДК, то есть отрицательны; аналиты видны четко при низкой концентрации 1 нг.

Заключение

Остатки антибиотиков в пищевых продуктах представляют серьезную проблему, несмотря на критическую необходимость в поддержании биологических объектов животноводства. Эта характеристика продукции животноводства является одним из приоритетных показателей при оценке безопасности. Анализ и модификация традиционных методов контроля за остаточным содержанием антибиотиков необходимы в условиях возросшей нагрузки на надзорные структуры, оценивающие безопасность продуктов питания.

Исключение из процесса пробоподго-товки образцов для определения антибиотиков тетрациклиновой группы этапа твердофазной экстракции (ТФЭ) позволяет значительно сократить продолжительность, трудоемкость метода, а также снизить его стоимость без потери качества проводимого исследования, не выходя за рамки Технического регламента [22].