Роль метилирования генов WIF1, RASSF1A, CDO1, MEST и CHL1 в метастатическом поражении регионарных лимфатических узлов у больных раком молочной железы

Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее часто диагностируемой злокачественной опухолью в мире и одной из основных причин смерти от онкологических заболеваний. Согласно российским данным, только в 2023 году было выявлено около 77 тысяч новых случаев этой патологии. По современным представлениям, развитие подавляющего большинства злокачественных опухолей связано с нарушениями в системе эпигенетического контроля, где центральное место занимают процессы аномального метилирования геномной ДНК [1]. Эпигенетические модификации обратимы, тогда как генетические изменения (мутации) необратимы, поэтому разработка препаратов, воздействующих на обратимые процессы, представляет собой более привлекательную стратегию для лечения РМЖ [2]. Аберрантное метилирование ДНК считается событием, ассоциированным со злокачественными новообразованиями, и характеристика опухолеспецифического метилома стала предметом многочисленных исследований [3–5]. Гипер- или гипометилирование ДНК является ранним событием в канцерогенезе молочной железы. Эти данные указывают на перспективность изучения уровня метилирования в опухолевой ткани РМЖ.

Многочисленные исследования демонстрируют, что у пациенток с РМЖ и наличием метастазов в лимфатических узлах (ЛУ) уровень метилирования ДНК ключевых генов-супрессоров опухоли достоверно выше, чем у пациенток без метастазов [6, 7]. В частности, наиболее значимые эпигенетические изменения наблюдаются в генах RASSF1A , APC и GSTP1 , а метилирование трёх и более генов позволяет предсказать метастазы с высокой чувствительностью и специфичностью [6]. Согласно данным Е.А. Филипповой и соавт. [2], гиперметилирование генов APAF1 , BAK1 и DAPK1 статистически значимо связано с диагностированием РМЖ на поздних стадиях и большим размером первичной опухоли (Т3–Т4). При этом метилирование APAF1 и BIM коррелировало с наличием лимфогенных метастазов. Важным результатом этой работы также стало описание положительных корреляционных связей между уровнями метилирования в парах генов: BCL2 и BIM , APAF1 и DAPK1 , APAF1 и BIM , APAF1 и BCL2 [2].

RASSF1A (член семейства Ras-ассоциативных доменов 1A) — ген, кодирующий белок, участвующий в регуляции апоптоза (программируемой клеточной гибели), стабилизации микротрубочек, а также осуществляющий контроль пролиферации клеток и регуляцию гена MDM2 . Последний, в свою очередь, ответственен за регуляцию гена TP53 [7]. Сведения о частоте метилирования промотора гена RASSF1A в литературе характеризуются значительной противоречивостью, а показатели его встречаемости в 3

различных исследованиях колеблются в очень широком диапазоне — от 19% до 87% [8]. В исследовании А.М. Бурденного и соавт. была установлена связь между метилированием гена RASSF1A при РМЖ и более агрессивными характеристиками опухоли: большим размером и высокой степенью злокачественности. При этом не выявлено корреляции с гистологическим типом РМЖ или наличием метастазов в ЛУ [8]. H.A. Hagrass и соавт. показали, что гиперметилирование гена-супрессора RASSF1A является частым событием при РМЖ и связано с потерей его белковой экспрессии. Это эпигенетическое изменение чаще встречалось при агрессивных формах болезни — поздних стадиях и тройном негативном подтипе РМЖ. Клинически метилирование RASSF1A коррелировало с худшим прогнозом, включая снижение 5-летней выживаемости и повышение риска рецидива. Таким образом, авторы показали, что RASSF1A функционирует как опухолевый супрессор и его эпигенетическая инактивация играет важную роль в прогрессировании РМЖ [9]. Метаанализ, проведённый M. Li и соавт., подтвердил, что метилирование гена RASSF1A является высокоспецифичным маркером для диагностики РМЖ. Этот эпигенетический тест обладает наибольшей точностью при анализе образцов опухолевой ткани [10].

Ген WIF1 (Wnt inhibitory factor) обычно действует как супрессор опухолей, ингибируя сигнальный путь Wnt, который участвует в пролиферации и миграции клеток. При многих солидных опухолях, включая РМЖ, экспрессия WIF1 часто снижается, в первую очередь из-за аберрантного метилирования промоторной области гена. Эта потеря функции WIF1 позволяет пути Wnt стать гиперактивным, что способствует росту опухоли и потенциальному метастазированию. В исследовании L. Ai и соавт. было показано, что эпигенетическая инактивация гена WIF1 является частым событием при РМЖ. Метилирование гена приводит к «выключению» его активности, что способствует активации онкогенного Wnt/β-катенинового пути и стимулирует рост опухоли. Отмечено также, что эта инактивация чаще встречается при гормон-негативных подтипах рака [11].

Ген CDO1 (Cysteine Dioxygenase 1) кодирует фермент, участвующий в обмене веществ. При раке он часто «выключается» (гиперметилируется), что ведёт к активации Wnt/β-катенинового пути — ключевого механизма роста опухоли. В норме CDO1 подавляет этот путь, уменьшая уровень онкогенных белков и повышая уровень белка, сдерживающего метастазирование. J. Yang и соавт. установили, что ген CDO1 часто инактивирован (гиперметилирован) при РМЖ, особенно при его агрессивных формах. С помощью технологии CRISPR исследователи смогли целенаправленно деметилировать промоторную область CDO1 и восстановить его экспрессию в опухолевых клетках, что привело к резкому подавлению роста опухоли и её способности к метастазированию в экспериментах на животных. Эти результаты указывают на CDO1 как на перспективную мишень для эпигенетической терапии рака [12]. В недавнем исследовании S. Fujino и соавт. было показано, что восстановление экспрессии CDO1 в опухолевых клетках (после деметилирования) приводит к индукции нескольких генов-супрессоров опухолей, включая DEFB1 , HOPX и FRMD3 . Корреляционный анализ на клинических образцах РМЖ продемонстрировал значимые ассоциации между CDO1 и другими ключевыми генами, включая SLC1A7 и KITLG , что подчёркивает его значимость в биологии опухолей. Функциональные анализы показали, что экспрессия CDO1 связана с усилением апоптоза и снижением жизнеспособности клеток, что указывает на защитную роль CDO1 в прогрессировании опухоли. Кроме того, происходят изменения в онкогенных путях, связанных с внеклеточным матриксом ( SGRN ) и протеазой ( ADAMTS1 ), что позволяет предположить: CDO1 может снижать метастатический потенциал, вероятно, посредством стромального репрограммирования [13]. В исследовании Y. Tanaka и соавт. было установлено, что метилирование гена CDO1 чаще наблюдается при агрессивных подтипах РМЖ. Этот эпигенетический маркер служит независимым фактором плохого прогноза, указывая на высокий риск рецидива при люминальном В и HER2-позитивном раке. Таким образом, анализ метилирования CDO1 может помочь в выборе более интенсивной терапии для пациенток с неблагоприятным прогнозом [14]. В исследовании D. Dietrich и соавт.

показано, что высокий уровень метилирования гена CDO1 является надёжным маркером неблагоприятного прогноза у пациенток с ER-положительным РМЖ и метастазами в ЛУ. У таких пациенток отмечалась значительно более низкая 5-летняя выживаемость, особенно при HER2-негативном подтипе опухоли, где риск смерти возрастал в 2,5 раза. Авторы предполагают, что CDO1 служит независимым прогностическим фактором, что подчёркивает его клиническую значимость для стратификации риска [15].

MEST (Mesoderm-specific transcript), кодируемый одноимённым импринтированным геном, предположительно выполняет функцию негативного регулятора клеточной дифференцировки [16]. Исследование M.S. Kim и соавт. выявило новую роль гена MEST в развитии агрессивного РМЖ. Показано, что он стимулирует процесс метастазирования, активируя путь STAT3/Twist-1 и запуская эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП). Эксперименты с нокаутом гена подтвердили его функцию: отключение MEST значительно снижало способность клеток к инвазии и метастазированию. Клинически высокая экспрессия этого гена была связана с более агрессивными подтипами рака, в частности с тройным негативным, и ухудшала прогноз выживаемости пациенток [17].

Таким образом, эпигенетические изменения, связанные с метилированием генов, часто возникают на ранних стадиях опухолеобразования, предшествуют генетическим мутациям и делают их привлекательными биомаркерами для ранней диагностики РМЖ, а также для изучения их роли в прогрессировании и метастазировании заболевания [18,19].

Цель – оценить предиктивную роль гиперметилирования специфической панели генов ( WIF1 , RASSF1A , CDO1 , MEST , CHL1 ) в отношении развития лимфогенных метастазов при первичном инвазивном РМЖ.

Материал и методы

Дизайн исследования и характеристика пациентов

В исследование были включены 112 пациенток с люминальными подтипами рака молочной железы (РМЖ) — люминальным А и люминальным B HER2-негативным, получавших лечение в ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России. Критерием включения являлось наличие первично-операбельной опухоли. Критериями исключения служили: проведение неоадъювантной терапии, наличие сопутствующих злокачественных новообразований, а также острые воспалительные или инфекционные заболевания в активной фазе.

Для анализа использовали гистологические срезы опухолей, а также комплекс клинико-анамнестических, лабораторных и инструментальных данных, извлечённых из медицинских карт стационарных и амбулаторных пациенток. Протокол исследования получил одобрение локального этического комитета ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России.

Размеры изученных опухолей составили от 0,9 до 5,0 см. В 47 случаях (42%) были верифицированы метастазы хотя бы в один лимфатический узел (ЛУ). Клиникоморфологическая характеристика случаев представлена в табл. 1 и 2.

Таблица 1. Клинические и морфологические параметры в подгруппе пациенток с люминальным А подтипом РМЖ

Характеристика Characteristic	/	Есть метаст Metastases (n=22)	азы / present	Нет метастазов / Metastases absent (n=44)	p
Возраст, лет / Age, years		56 (45,5; 59)		60,5 (53; 68)*	0,027*
Размер опухоли, см / size, cm	Tumor	2,45 (1,75; 3,0)		1,85 (1,37; 2,2)	0,021*
Экспрессия ПР, %	/ PR	85 (15; 100)		90 (35; 100)	0,74

Характеристика Characteristic	/	Есть метастазы / Metastases present (n=22)	Нет метастазов / Metastases absent (n=44)      p
expression, %
Ki67, % / Ki67, %		10,5 (6,25; 15)	11,5 (7; 15)                     0,76
Гистологический вариант / Histological variant
протоковый / ductal		36,3% (8)	22,7% (10)                  0,26
дольковый / lobular		31,8% (7)	22,7% (10)                   0,55
протоково-дольковый lobular	/ ductal-	22,7% (5)	38,6% (17)                   0,27
другой / other		9,2% (2)	16,0% (7)                    0,70
*Примечание: данные представлены в виде медианы (25-й; статистически значимые различия (p < 0,05).*			75-й процентили) или % (n). * —

Таблица 2. Клинические и морфологические параметры в подгруппе пациенток с люминальным В подтипом РМЖ

Характеристика / Characteristic	Есть метастазы / Metastases present (n=26)	Нет метастазов / Metastases absent (n=20)	p
Возраст, лет / Age, years	55 (44,2; 59,7)	52,5 (42,7; 60,2)	0,68
Размер опухоли, см / Tumor size, cm	2,7 (2,1; 3,0)	2,1 (1,7; 2,5)	0,009*
Экспрессия ПР, % / PR expression, %	45 (10; 77,5)	80 (67,5; 95)	0,02*
Ki67, % / Ki67, %	28 (25; 43,7)	32,5 (24; 37,2)	0,96
Гистологический вариант / Histological variant
протоковый / ductal	27% (7)	35% (7)	0,75
дольковый / lobular	23% (6)	15% (3)	0,71
протоково-дольковый / ductal-lobular	42,3% (11)	45% (9)	1,00
другой / other	7,7% (2)	5% (1)	1,00

*Примечание: данные представлены в виде медианы (25-й; 75-й процентили) или % (n). * — статистически значимые различия (p < 0,05).*

Для оценки уровня метилирования пяти генов ( RASSF1A , CDO1 , WIF1 , MEST , CHL1 ) в опухолевой ткани РМЖ были сформированы две группы сравнения:

• •    образцы здоровой ткани молочной железы, полученные от пациенток без злокачественных новообразований (n=16);

• •    образцы ткани фиброаденомы (n=16).

Сопоставляли уровень метилирования ДНК в разных группах, а также изучали связь между уровнем метилирования и риском регионарного метастазирования.

После хирургического удаления образцы опухолевой ткани без фиксации незамедлительно доставляли в патологоанатомическое отделение. Весь процесс предварительной обработки — от поступления материала до его фиксации — занимал не более 30–40 минут. Из каждого макропрепарата патологоанатом вырезал по два фрагмента опухоли размером 5×5×5 мм, которые сразу помещали в 2 мл криопробирок, содержащих стабилизирующий раствор RNAlater.

Геномную ДНК экстрагировали с использованием коммерческого набора QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, США). Затем проводили бисульфитную конверсию ДНК с помощью набора EpiJET Bisulfite Conversion Kit (Thermo Scientific, США).

Для количественной оценки степени метилирования промоторных регионов целевых генов применяли метод высокоразрешающего плавления с метилирование-чувствительными праймерами (Methylation-Sensitive High-Resolution Melting, MS-HRM). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с праймерами, специфичными к CpG-островкам исследуемых генов (табл. 3). Протокол амплификации включал три этапа:

• 1.    Первичная денатурация при 95 °C в течение 5 минут.

• 2.    Амплификация (30 циклов): денатурация при 95 °C – 15 секунд, отжиг при 60 °C – 30 секунд, элонгация при 72 °C – 45 секунд.

• 3.    Этап детекции (25 циклов): денатурация при 95 °C – 15 секунд, отжиг при 50 °C – 30 секунд, элонгация при 72 °C – 45 секунд.

После завершения ПЦР проводили высокоразрешающее плавление продуктов амплификации с последующим анализом полученных кривых.

Таблица 3. Праймеры, использованные для MS-HRM

Ген / Gene	Прямой праймер / Forward primer	Обратный праймер / Reverse primer	Количеств о CpG-сайтов / Number of CpG sites	Размер продукта, п.н. / Product size, bp
WIF1	GAGTGATGTTTTAGGG GT	CCTCAACCAAAACT ATTCC	46	464
RASS F1A	GGGTTAAGGTATTTTA AAGATAAGAA	ACAACTAATCCCTA ACC	36	389
CDO 1	GGGAGGATGAATTTT ATAGATTTG	TAAACTTCCATAAT AACCTACACCTC	25	396
MEST	ATTAGGGGAAGGGTT GAAATA	CAAATAAAACCTTA CCTACAAAACTC	26	416
CHL1	GTGTAAAGGGAGGGA AGATAAG	AACCCCCACCCCTA ACACAC	41	366

После амплификации к продуктам ПЦР добавляли интеркалирующий краситель EVAGreen (Синтол, Россия). Плавление и детекцию проводили на амплификаторе CFX96 (BioRad, США) по следующей программе: 95 °C – 30 секунд, 60 °C – 10 минут, затем нагрев от 60 °C до 90 °C с шагом 0,2 °C/секунду. Кривые анализировали с помощью программного обеспечения Precision Melt Analysis Software v.3.0 (BioRad, США), нормализуя все данные относительно неметилированного контроля. Уровень метилирования количественно оценивали путём сравнения относительных единиц флуоресценции (ΔRFU) в точках максимумов нормированных кривых (рис. 1).

Рис. 1. Расчет относительного уровня метилирования на основании значений RFU, измеренных при температуре, соответствующей максимумам пиков на кривых высокоразрешающего плавления (T max peak). Кривая 1 соответствует неметилированному продукту, а кривые 2 и 3 отражают образцы, содержащие смесь метилированной и неметилированной ДНК.

Оценка уровня метилирования проводилась путем измерения RFU в точках максимумов пиков кривых высокоразрешающего плавления (HRM). Качество и специфичность проведенной ПЦР дополнительно контролировали методом электрофоретического разделения продуктов в полиакриламидном геле (рис. 2). Последовательности ДНК-продуктов были подтверждены методом пиросеквенирования.

Рис. 2. Продукты ПЦР реакций: 1 – WIF1 , 2 – RASSF1A, 3 – CHL1, 4 – CDO1 , 5 – MEST.

Результаты

Первым этапом был проведён анализ уровня метилирования исследуемых генов в опухолевой ткани РМЖ по сравнению с контрольными группами (нормальная ткань молочной железы и ткань фиброаденомы).

Ген RASSF1A . Продуктом гена является белок RASSF1A, участвующий в механизмах клеточной дифференцировки. Для формирования «бессмертной» опухоли необходимо выключение механизмов, ответственных за дифференцировку клеток при каждом делении, что приводит к метилированию гена RASSF1A практически во всех типах солидных опухолей. Сравнение подтипов РМЖ и контрольных групп показало, что опухолевая ткань 8

характеризуется высоким уровнем метилирования независимо от молекулярного подтипа карциномы. Уровень метилирования в опухолях каждого подтипа достоверно выше, чем в контрольных группах (рис. 3).

Рис. 3 . Относительный уровень метилирования гена RASSF1A в разных группах: F – ткань фиброаденомы, N – нормальная ткань молочной железы, люмА – люминальный А подтип РМЖ, люмВ – люминальный В HER2-негативный подтип РМЖ.

Ген CDO1 . Белок CDO1 представляет собой железосодержащий металлофермент, участвующий в превращении цистеина в цистеинсульфиновую кислоту. Сравнение подтипов РМЖ и контрольных групп показало, что опухолевая ткань имеет высокий уровень метилирования независимо от подтипа. В нормальной ткани метилирование практически отсутствует (рис. 4).

Рис. 4 . Относительный уровень метилирования гена CDO1 в группах сравнения.

Обозначения: F, N, люмА, люмВ – как на рис. 3.

Ген WIF1 . Белок WIF1 связывается с WNT и таким образом блокирует WNT-сигнальный путь, управляющий клеточной пролиферацией. Сравнение подтипов РМЖ и контрольных

групп показало, что уровень метилирования в люминальном В HER2-негативном подтипе достоверно выше, чем в люминальном А подтипе и нормальной ткани. Метилирование в люминальном А подтипе также достоверно выше, чем в нормальной ткани (рис. 5).

Рис. 5 . Относительный уровень метилирования гена WIF1 в группах сравнения. Обозначения: F, N, люмА, люмВ – как на рис. 3.

Ген CHL1 . CHL1 кодирует трансмембранный белок иммуноглобулиноподобного суперсемейства L1 – молекулу клеточной адгезии. Сравнение подтипов РМЖ и контрольных групп показало, что опухолевая ткань имеет достоверно более высокий уровень метилирования, чем ткань фиброаденомы, независимо от подтипа. Однако при дальнейшем анализе связи с лимфогенным метастазированием статистически значимых ассоциаций для гена CHL1 выявлено не было, поэтому он не был включён в основные прогностические модели.

На втором этапе работы был проведён сравнительный анализ уровня метилирования генов WIF1 , RASSF1A , CDO1 и MEST в ткани первичной опухоли между люминальным А и люминальным В HER2-негативным подтипами РМЖ. Результаты показали статистически значимые различия (рис. 6).

Уровень метилирования генов WIF1 и CDO1 был достоверно выше в опухолях люминального В подтипа по сравнению с люминальным А (p <0,001 и p =0,002 соответственно). Для гена MEST в той же группе (люминальный В) зафиксировано статистически значимое снижение уровня метилирования (p =0,033). Уровень метилирования RASSF1A достоверно не различался между подтипами.

Рис. 6 . Относительный уровень метилирования генов WIF1 , RASSF1A , CDO1 и MEST в первичной опухоли при люминальном А и люминальном В (HER2–) подтипах. *p <0,05.

Выявленные различия в паттерне метилирования генов между подтипами люминального А и люминального В HER2-негативного РМЖ обосновали необходимость изучения роли эпигенетических изменений в лимфогенном метастазировании для каждой молекулярной группы отдельно.

При сравнении образцов первичной опухоли люминального А подтипа установлено, что наличие метастазов в регионарных лимфатических узлах (ЛУ) статистически значимо ассоциировано только с уровнем метилирования гена WIF1 (p=0,03) (рис. 7). Для остальных исследованных генов значимых различий между группами с метастазами и без них не выявлено.

Рис. 7 . Сравнение уровня метилирования генов WIF1 , RASSF1A , CDO1 и MEST в первичной опухоли люминального А подтипа между группами пациенток с наличием (LN+) и отсутствием (LN–) метастазов в регионарных лимфатических узлах. *p <0,05.

Корреляционный анализ выявил значимую взаимосвязь метилирования гена WIF1 с метилированием RASSF1A (p = 0,001) и CDO1 (p <0,001), но не с размером опухоли.

Дальнейший анализ был ограничен опухолями размером >2 см, поскольку мы предположили, что опухоли <2 см, даже обладая необходимыми молекулярными свойствами для метастазирования, могут не иметь достаточной клеточной массы для его клинической реализации. В подгруппе пациенток с люминальным А подтипом и размером опухоли >2 см (n=33), из которых у 20 (60,6%) имелись метастазы в ЛУ, различия в метилировании гена WIF1 между группами с метастазами и без них достигли более высокой статистической значимости (p = 0,009). ROC-анализ для WIF1 показал AUC = 0,76 (95% ДИ: 0,59–0,93).

При оценке первичных опухолей люминального В (HER2–) подтипа различия в уровне метилирования между группами с разным лимфоузловым статусом были выявлены для трёх генов: RASSF1A (p = 0,03), CDO1 (p = 0,048) и MEST (p = 0,045) (рис. 8).

люминального В (HER2–) подтипа, стратифицированный по наличию (LN+) или отсутствию

(LN–) метастазов в ЛУ. *p <0,05.

Корреляционный анализ обнаружил достоверные взаимозависимости в характере метилирования: уровень метилирования гена RASSF1A положительно коррелировал с метилированием CDO1 (p = 0,025) и отрицательно – с метилированием гена MEST (p = 0,001).

Для оценки совместной прогностической ценности этих генов при люминальном В HER2-негативном подтипе была построена модель логистической регрессии. Согласно данным ROC-анализа, объединённый показатель метилирования генов RASSF1A , CDO1 и MEST обладает способностью прогнозировать лимфогенное метастазирование с площадью под кривой (AUC), равной 0,74 (95% ДИ: 0,6–0,88).

При анализе подгруппы пациенток с люминальным В (HER2–) подтипом и размером опухоли >2 см (n=33, из них у 20 пациенток имелись метастазы) выраженных различий в метилировании генов RASSF1A , CDO1 и MEST между группами выявлено не было (p = 0,089, p = 0,076 и p = 0,046 соответственно). Уровень метилирования WIF1 также не коррелировал с метастатическим статусом. Однако базальный уровень WIF1 в этих опухолях оказался существенно выше, чем в люминальном А подтипе, где такая связь чётко выражена. Это позволяет предположить, что изначально высокое метилирование WIF1 может формировать молекулярный фон, благоприятный для лимфогенного метастазирования при люминальном В подтипе РМЖ.

Обсуждение

Результаты исследования дополняют и уточняют современные представления о роли эпигенетических нарушений в развитии и прогрессировании люминальных подтипов рака 12

молочной железы (РМЖ). Наши данные демонстрируют, что профиль метилирования ключевых генов-супрессоров опухоли не только отличает злокачественную ткань от нормальной, но и имеет существенные различия между молекулярными подтипами, что, вероятно, отражает вариабельность их биологического поведения и клинического прогноза.

Примечательно, что в нашем исследовании выявлен сниженный уровень метилирования промотора гена MEST при люминальном В подтипе РМЖ. Поскольку гиперэкспрессия MEST часто ассоциирована с неблагоприятным прогнозом, наблюдаемый паттерн может указывать на альтернативные, не связанные с промоторным гиперметилированием, механизмы активации этого гена в агрессивной субпопуляции опухолей. Обнаруженная сильная обратная корреляция между метилированием RASSF1A и MEST также подчёркивает сложность эпигенетической сети регуляции, требующей детального изучения.

Для выяснения этих механизмов в будущих исследованиях целесообразно использовать следующие подходы:

• 1.    Комплексный эпигеномный и транскриптомный анализ. Полногеномное исследование метилирования (например, с помощью массива EPIC) и RNA-seq на одной и той же когорте опухолей люминального В подтипа позволят определить, коррелирует ли экспрессия MEST с метилированием других регуляторных областей (например, энхансеров) или с активностью специфичных транскрипционных факторов.

• 2.    Функциональная валидация in vitro . На клеточных линиях люминального В РМЖ следует изучить эффекты нокдауна или сверхэкспрессии MEST на фенотипы, связанные с метастазированием (инвазия, миграция). Одновременно можно оценить влияние деметилирующих агентов (например, 5-азацитидина) на уровень мРНК и белка MEST в этих клетках, чтобы проверить, находится ли ген под классическим эпигенетическим контролем.

• 3.    Анализ изоформ и посттранскрипционной регуляции. Исследовать экспрессию различных изоформ MEST с помощью ПЦР в реальном времени или Nanostring-анализа, а также оценить потенциальную роль микроРНК, нацеленных на MEST , дисрегуляция которых характерна для люминального В подтипа.

• 2.    Различные эпигенетические драйверы лимфогенного метастазирования

• 3.    Клинические перспективы и ограничения исследования

Реализация этих шагов позволит не только объяснить парадоксально низкий уровень промоторного метилирования MEST при потенциально высокой онкогенной активности этого гена, но и идентифицировать новые мишени для терапии.

Результаты исследования показывают, что эпигенетические детерминанты риска метастазирования в подмышечные лимфатические узлы (ЛУ) различаются в зависимости от молекулярного подтипа опухоли.

Для люминального А подтипа РМЖ ключевым прогностическим маркером оказалось метилирование гена WIF1. Этот ген является важным ингибитором Wnt-сигналинга, и его эпигенетическое «выключение» может способствовать потере межклеточных контактов и повышению инвазивного потенциала, что критично для метастазирования именно в этом, как правило, менее агрессивном подтипе. Высокая диагностическая точность (AUC = 0,76) для опухолей размером >2 см делает метилирование WIF1 перспективным критерием для стратификации риска у пациенток с люминальным А РМЖ.

Отсутствие значимой ассоциации метилирования гена CHL1 с метастазированием в нашем исследовании, несмотря на его гиперметилирование в опухолях по сравнению с доброкачественными образованиями, может свидетельствовать о том, что его инактивация является более ранним событием в канцерогенезе и не играет определяющей роли именно на этапе лимфогенной диссеминации при люминальных подтипах.

Для люминального В HER2-негативного подтипа риск метастазирования был ассоциирован с комплексным эпигенетическим профилем, включающим гены RASSF1A , CDO1 и MEST . Это согласуется с представлением о более гетерогенной и биологически агрессивной природе данного подтипа, где на процесс метастазирования влияет не единичное нарушение, а комбинация эпигенетических событий, затрагивающих разные клеточные пути (апоптоз, метаболизм цистеина, клеточную адгезию/сигнализацию). Статистическая модель, объединяющая эти три маркера, показала хорошую прогностическую способность (AUC = 0,74).

Полученные данные обосновывают целесообразность подтип-специфичного эпигенетического профилирования для оценки риска лимфогенного метастазирования при РМЖ. Включение анализа метилирования WIF1 в алгоритм обследования пациенток с люминальным А РМЖ, особенно при опухолях T1–2, вероятно, сможет помочь в принятии решения об объёме хирургического лечения (биопсия сторожевого ЛУ против полной лимфодиссекции) или о необходимости адъювантной терапии. Для люминального В подтипа комбинированный анализ нескольких генов может повысить точность прогноза.

Основными ограничениями исследования являются его ретроспективный характер и относительно небольшой размер выборки, особенно при стратификации по подтипам и статусу ЛУ. Для валидации полученных результатов и оценки их независимой прогностической ценности необходимы проспективные исследования на более крупных когортах пациенток. Кроме того, для улучшения визуализации данных в будущих работах целесообразно использовать графики, более полно отображающие распределение данных (например, боксплоты).

Заключение

Настоящее исследование демонстрирует принципиальное различие в эпигенетических механизмах, определяющих лимфогенный метастатический потенциал при разных люминальных подтипах РМЖ. Показано, что ключевые гены-супрессоры опухолевой прогрессии подвергаются метилированию в подтип-специфическом паттерне, что открывает новые возможности для прецизионной стратификации риска.

Для люминального А РМЖ критическим фактором, вероятно, является гиперметилирование и, как следствие, инактивация гена WIF1 – основного супрессора Wnt-сигнального каскада. Этот единичный маркер показал высокую прогностическую ценность, особенно в подгруппе опухолей размером более 2 см.

Для люминального В HER2-негативного подтипа характерен комплексный эпигенетический профиль. Прогностически значимой для оценки риска метастазирования оказалась не единичная аберрация, а комбинированная модель, учитывающая одновременное изменение уровня метилирования трёх генов: RASSF1A , CDO1 и MEST . Это указывает на то, что метастатический потенциал в данном случае определяется совокупностью скоординированных эпигенетических нарушений, а не инактивацией одного ключевого регулятора. Обнаруженная сильная обратная корреляция между метилированием RASSF1A и MEST подчёркивает сложное взаимодействие в регуляторной сети, характерное для данного подтипа.

С клинической точки зрения, результаты работы могут обосновать целесообразность дифференцированного подхода к эпигенетической диагностике. Для пациенток с люминальным А подтипом РМЖ предложено включить в алгоритм обследования анализ метилирования WIF1 , что, вероятно, позволит более точно определять показания к объёмной лимфодиссекции или интенсификации адъювантной терапии. Для люминального В HER2-негативного подтипа может быть рекомендовано использование комбинированной эпигенетической панели ( RASSF1A , CDO1 , MEST ) для выделения группы высокого риска раннего рецидивирования.

Таким образом, выявленные подтип-специфичные эпигенетические маркеры представляют собой перспективный инструмент для персонализированной оценки риска лимфогенного метастазирования при люминальном РМЖ. Внедрение предложенных диагностических алгоритмов в клиническую практику после валидации на независимых когортах позволит оптимизировать лечебную тактику и улучшить долгосрочные результаты лечения.

Вклад авторов. Кометова В.В., Михалёва Л.М., Родионов В.В. – концепция и дизайн исследования; Кометова В.В., Красный А.М. – сбор и обработка материала, статистическая обработка данных; Кометова В.В., Родионов В.В., Киреев А.А. – написание текста; Михалёва Л.М., Родионов В.В., Киреев А.А. – редактирование.

Соблюдение прав пациентов и правил биоэтики. Протокол исследования одобрен комитетом по биомедицинской этике ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава РФ, протокол №03 от 21.03.2024. Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании.

Финансирование. Работа выполнена в рамках Государственного задания «Персонификация адьювантной терапии больных с люминальными Her2-негативными подтипами рака молочной железы с использованием предоперационного теста на гормоночувствительность» (номер государственного учета НИОКТР 124020600031-3).