Статьи журнала - Сельскохозяйственная биология
Все статьи: 1632
Статья научная
Способность Bacillus subtilis продуцировать разнообразные по структуре и свойствам биологически активные метаболиты в значительной степени обусловливает ее фунгицидный эффект в отношении особо опасных фитопатогенных грибов. В настоящей работе из культуральной жидкости штаммов B. subtilis BZR 336g и BZR 517 впервые выделены антигрибные метаболиты, подавляющие развитие вредоносных фитопатогенных грибов, изучены свойства и химическая структура этих соединений с использованием оригинальных аналитических подходов. Целью работы было обнаружение, описание и количественная оценка антифунгальной активности метаболитов у двух штаммов Bacillus subtilis - перспективных продуцентов биофунгицидов. Используемый нами методический подход включал очистку бактериальных метаболитов экстракцией этилацетатом, разделение методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах с силикагелем с УФ-визуализацией (λ = 366 нм), применение детектирующих реактивов, спектроскопию и биоавтографию. Модификация метода биоавтографии заключалась в использовании фитопатогенные грибы - возбудители вредоносных заболеваний сельскохозяйственных культур Fusarium oxysporum var...
Бесплатно
Выделение и характеристика примордиальных зародышевых клеток кур
Статья научная
Оптимизированы условия выделения примордиальных зародышевых клеток кур (кросс Птичное) из 4-8-суточных эмбрионов. Установлено, что эффективным методом дезагрегации куриных эмбрионов с целью получения эмбриональных клеток служит ферментативная обработка 0,05 % трипсином. Максимальное количество примордиальных зародышевых клеток может быть выделено из 6-суточных эмбрионов с последующим разделением суспензии клеток по адгезии после 90 мин культивирования при использовании эмбриональных фибробластов кур в качестве фидерного слоя. При инкубации ПЗК на фидерном слое жизнеспособность клеток сохранялась более длительное время — от 5 до 7 сут в зависимости от типа клеток, используемых в качестве фидерного слоя (перевиваемая клеточная линия STO, свежеизолированные и культивируемых в течение нескольких пассажей эмбриональных фибробластов кур).
Бесплатно
Выделение изолятов возбудителя мыта лошадей в условиях Крайнего Севера
Статья научная
Увеличение поголовья и продуктивности в табунном коневодстве сдерживается рядом факторов, среди которых значительное место занимают инфекционные и инвазионные болезни. Наиболее распространенным и причиняющим ощутимый экономический ущерб заболеванием остается мыт лошадей (возбудитель Streptococcus equi ). Заболевание широко распространено в странах азиатского континента, в России и странах СНГ. Для разработки вакцинного препарата против болезни важное значение имеет выделение ее возбудителя. В настоящей работе впервые в условиях Крайнего Севера выделены и идентифицированы три новых изолята возбудителя мыта Streptococcus equi , которые могут быть использованы для диагностики и разработки вакцины против мыта лошадей. Целью работы было выделение, изучение, идентификация по морфологическим, культуральным, биохимическим, молекулярно-генетическим свойствам новых изолятов возбудителя мыта лошадей для диагностики заболевания в условиях Крайнего Севера и разработки вакцины. Биологические пробы были собраны в 2015-2017 годах в хозяйствах Республики Саха (Якутия) (Намский, Хангаласский, Амгинский, Мегино-Кангаласский районы, г. Якутск), а также в Республике Казахстан. Всего исследовали 63 пробы от 6-10-месячных лошадей ( Equus ferus caballus ) якутской и казахской пород, в том числе 45 смывов носовых истечений (27 от клинически больных мытом жеребят, 18 от здоровых жеребят), 7 проб содержимого вскрывшихся абсцессов подчелюстных лимфатических узлов и 11 паренхиматозных органов павших от мыта жеребят. Перед бактериологическими исследованиями применяли предпосевную обработку. Морфологические и культуральные свойства изолятов изучали при высеве в мясопептонный бульон (МПБ) с 1 % глюкозой и 10 % лошадиной сывороткой, а также на мясопептонный агар (МПА) с 1 % глюкозой и 10 % сывороткой крови или 5 % дефибринированной кровью лошади. Мазки из гноя, препараты, приготовленные из культур, выращенных в жидкой и на агаризованной среде, фиксировали и окрашивали по Граму. Биохимические свойства культур исследовали при высеве на MПA с 40 % желчью, 6,5 % солевой MПA, агар с азидом натрия и среды Гисса с глюкозой, лактозой, маннитом, мальтозой, сахарозой, сорбитом и дульцитом. Видовую принадлежность изолятов определяли по биохимическим свойствам культуры с использованием стрипов API 20 Step тест системы API («bioMerieux», Франция). Вирулентную активность стрептококков определяли на белых беспородных мышах, которым подкожно вводили взвесь суточной культуры живых бактериальных клеток стрептококков в объеме 0,2-0,5 см3 (от 1×103 до 1×109 КОЕ/гол). ДНК выделяли из жидкой бактериальной культуры. Генетическое типирование изолятов Streptococcus выполняли методом ПЦР со штамм-специфическими праймерами Seel-F 5ʹ-CGGATACGGTGA-TGTTAAAGA-3ʹ и Seel-R 5ʹ-TTCCTTCCTCAAAGCCAGA-3ʹ. Нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК Streptococcus equi была секвенирована для шести изолятов мытного стрептококка, из которых три предлагается использовать для разработки вакцинных препаратов. Полимеразная цепная реакция со специфическими праймерами служит наиболее достоверным и быстрым методом идентификации мытного стрептококка. По результатам генотипирования и изучения культуральных, морфологических и биохимических свойств установлено, что изолят Н-5/1 относится к семейству Streptococcaceae , роду Streptococcus , виду Streptococcus equi ssp. equi и соответствует типовым характеристикам представителей этого вида. Нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16S рРНК изолята Н-5/1 после секвенирования депонирована в базе данных NCBI GenBank (MW486609). На основании проведенных исследований штамм Streptococcus equi Н-5/1 депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве ФГБУ ВГНКИ (регистрационный номер ВКШМ-Б-141П, справка о депонировании от 22 мая 2018 года). Получен патент на изобретение № 2703485 «Штамм бактерий Streptococcus equi, используемый для изготовления вакцины против мыта» от 17.10.2019 года. Новые изоляты Streptococcus equi могут быть использованы для разработки диагностических препаратов и вакцины против мыта лошадей. Также от клинически больных мытом жеребят были выделены культуры Enterococcus faecales , Streptococcus piogenes , токсигенные и плесневые грибы родов Aspergillus и Mucor , что необходимо учитывать при диагностике и профилактике мыта и других респираторных болезней молодняка лошадей.
Бесплатно
Выделение клеточных популяций из периферической крови сельскохозяйственных животных
Статья научная
Предложен способ выделения чистых популяций лимфоцитов, нейтрофилов и тромбоцитов из периферической крови сельскохозяйственных животных (овцы, лошади и крупный рогатый скот). Описаны последовательные стадии разработки приема разделения крови на клеточные фракции.
Бесплатно
Выделение, культивирование и характеристика примордиальных зародышевых клеток перепелов
Статья научная
Использование примордиальных зародышевых клеток (ПЗК) птицы для получения химерных и трансгенных особей рассматривается как альтернатива традиционным методам селекции и трансгенеза. Такой подход предусматривает введение донорских примордиальных зародышевых клеток в дорсальную аорту эмбрионов-реципиентов в период миграции этого типа клеток из крови в гонады. В случае колонизации донорскими ПЗК гонад эмбрионов-реципиентов возможна дальнейшая дифференцировка донорских клеток до зрелых половых клеток (как мужских, так и женских). При этом ключевой фактор, определяющий эффективность проводимых манипуляций, - использование чистой популяции зародышевых клеток. В этой связи остается актуальной разработка способов выделения и поддержания в культуре ПЗК - предшественников половых клеток. Целью наших исследований была оптимизация приемов получения и культивированию примордиальных зародышевых клеток перепелов ( Coturnix coturnix ). ПЗК выделяли из 5-6-суточных эмбрионов, применяя два методических подхода - механическую диссоциацию и ферментативную обработку. Механическую диссоциацию клеток проводили посредством измельчения эмбрионов с помощью пипетирования в среде DMEM в течение 5 мин. При ферментативной обработке эмбрионов в качестве протеолитического фермента использовали раствор трипсина (0,05; 0,10; 0,15 и 0,25 %). Для повышения доли ПЗК в получаемой суспензии эмбриональных клеток их разные типы разделяли по способности к адгезии. Морфологическую оценку свежевыделенной популяции эмбриональных клеток проводили визуально под фазово-контрастным микроскопом («Nikon», Япония). Для идентификации ПЗК в культуре применяли гистохимическое и иммуногистохимическое окрашивание. Установлено, что ферментативная обработка 0,05 % трипсином служит эффективным методом дезагрегации эмбрионов с сохранением жизнеспособности значительной доли (94 %) клеток. Разделение клеток разных типов с учетом их способности к адгезии позволило получать культуру ПЗК, максимально очищенную от других типов клеток. Единичные эмбриональные фибробласты, оставшиеся в клеточной суспензии ПЗК после отделения других клеток, при последующем культивировании служили фидерным слоем, на который прикреплялись ПЗК. Первичные собственные эмбриональные фибробласты оказались оптимальным фидерным слоем для краткосрочного культивирования ПЗК по сравнению с клетками ïåðåâèâàåìûõ ýìáðèîíàëüíûõ ôèáðîáëàñòîâ ìûøè ëèíèè STO и культивируемыми эмбриональными фибробластами. При использовании ростовой среды на основе DМЕМ с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л), дополненной фетальной сывороткой крови крупного рогатого скота (20 %), глутамином (2 мМ), 2-меркаптоэтанолом (10-6 мМ), LIF (leukemia inhibitory factor, 2 нг/мл), незаменимыми аминокислотами (MEM, 10 мM), антибиотиком гентамицином (50 мкг/мл), прикрепление ПЗК к фидерному слою наблюдали на 1-2-е сут культивирования с формированием колоний на 3-и-4-е сут. Наличие колоний ПЗК было подтверждено иммуногистохимически с помощью специфических первых антител к SSEA-1 (stage-specific embryonic antigen-1).
Бесплатно
Выделение, культивирование и характеристика сперматогониев петуха (Gallus gallus)
Статья научная
Использование клеток гонад самцов сельскохозяйственных животных и птицы для получения химерных и генетически модифицированных особей рассматривается как альтернатива традиционным методам селекции и модификации генома и открывает широкие возможности для получения особей с новыми заданными свойствами. В случае трансгенеза такой подход предусматривает целенаправленную генетическую модификацию половых клеток самцов при инъекции рекомбинантной ДНК непосредственно в паренхиму семенников взрослых особей (in vivo) или введении трансформированных донорских сперматогониев в семенники стерильных особей-реци-пиентов (ex vivo) и получении в дальнейшем потомства. В последнем случае ключевые факторы, определяющие эффективность проводимых манипуляций, - получение чистой популяции донорских клеток и элиминация собственных сперматогенных клеток (выключение сперматогенеза). В этой связи остается актуальной разработка эффективных методов выделения и поддержания в культуре стволовых клеток семенников - сперматогониев. Целью наших исследований была оптимизация методических подходов для выделения и культивирования сперматогониев петуха как одного из этапов технологии создания трансгенной птицы. В результате была получена и охарактеризована культура сперматогониев петуха. На основании данных гистологических исследований сперматогенеза у петухов было установлено, что в возрасте до 5 нед сперматогенные клетки представлены преимущественно одним типом клеток - сперматогониями. В связи с этим для получения культуры сперматогониев использовали семенники 2-недельных особей. Выделение сперматогенных клеток из тестикул петуха осуществляли посредством последовательной механической и ферментативной обработок ткани семенника. Для ферментативной диссоциации ткани семенника последовательно обрабатывали раствором коллагеназы в конечной концентрации 1 мг/мл в течение 20 мин и 0,25 % раствором трипсина в течение 30 мин. Для получения максимально чистой популяции сперматогониев учитывали неодинаковую способность разных типов клеток к адгезии. Было установлено, что через 24 ч культивирования первичной культуры тестикул петуха в ростовой среде присутствовали неприкрепившиеся клетки, представленные в основном сперматогенными клетками - сперматогониями. Не прикрепившиеся клетки осаждали и высевали в культуральные чашки с разными фидерными слоями. В качестве фидерных слоев использовали перевиваемую клеточную линию STO, перевиваемые клетки Сертоли свиней (ПТП), клеточную линию Sc, первичные клетки Сертоли петуха. Осуществляли также культивирование сперматогониев на чашках с 0,2 % желатином. Ростовой средой для культивирования сперматогониев служила среда DMEM с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л), дополненная 5 % сывороткой плода коровы («GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories», США); 2 мМ a-глутамином, МЕМ (Minimum Essential Medium, 10 мкл/мл), антибиотиком (100х), меркаптоэтанолом (5х10-5 М), альбумином (5 мг/мл) («Invitrogen», США); DL-lactic acid (1 мкл/мл), EGF (epidermal growth factor, 20 нг/мл), bFGF (basic fibroblast growth factor, 10 нг/мл) и LIF (leukemia inhibitory factor, 2 нг/мл) («Sigma-Aldrich Сo.», США). Колонии сперматогониев формировались на 3-и-4-е сут культивирования. Оптимальным фидерным слоем для культивирования сперматогониев петуха оказались собственные клетки Сертоли. Наличие колоний сперматогониев подтвердили на 7-суточной культуре иммуногистохимически, использовав специфические антитела к SSEA-1 (stage-specific embryonic antigen-1).
Бесплатно
Выживаемость эмбрионов и повышение темпов генетического прогресса в молочных стадах (обзор)
Статья обзорная
Непрерывность генетического прогресса и применение передовых технологий при разведении высокопродуктивного скота - отличительные черты современного молочного скотоводства (G.R. Wiggans с соавт., 2017; B.V. Sanches с соавт., 2019). На примере коров голштинской породы североамериканской селекции показано, что за 50-летний период (1963-2013 годы), в течение которого надои молока удвоились (с 6619 кг до 12662 кг), генетические изменения составили более 56,0 % (A. Garcia-Ruiz с соавт., 2016). Генетические усовершенствования, направленные на повышение молочной продуктивности, повлекли за собой снижение репродуктивной способности и нарушение здоровья у коров (J. Kropp с соавт., 2014; L. Hyun-Joo с соавт., 2015, B. Fessenden с соавт., 2020), что до сих пор остается глобальной проблемой (E.S. Ribeiro с соавт., 2012; K.J. Perkel с соавт., 2015). В 30-50 % случаев высокоудойные коровы подвержены маститам, метритам, хромоте и другим заболеваниям (I. Cruz с соавт., 2021), а при оплодотворении 90-95 % средний показатель отела составляет около 40-50 % (M.G. Diskin с соавт., 1980; P. Humblot с соавт., 2001). Эмбриональный период у коров продолжается до 42-45-х сут стельности (J. Peippo с соавт., 2011) и характеризуется высокой (до 40 %) эмбриональной смертностью (D.C. Wathes, 1992; K.J. Perkel с соавт., 2015; P. Rani с соавт., 2018), полифакторная этиология которой до сих пор не изучена. Потери генетического потенциала (нерожденные быки-производители, ремонтные телки, матери быков-производителей, доноры эмбрионов) приводят к замедлению селекционного процесса в молочных стадах (M. Ptaszynska, 2009). Настоящий обзор отражает современные данные о генетической предрасположенности эмбриона к выживанию как одному из важных факторов, детерминирующих наступление и развитие стельности у молочных коров. Приведены данные о выживаемости бластоцист в стрессовых условиях их получения in vivo или in vitro, после криоконсервации и оттаивания (J.L.M. Vasconcelos с соавт., 2011; C. Galli, 2017; H. Erdem с соавт., 2020) и бисекции (микрохирургическое деление эмбриона пополам с получением двух деми-эмбрионов) (Y. Hashiyada, 2017). Данные о способности эмбрионов к выживанию с генетической точки зрения становятся все более объективными по мере обнаружения генов-кандидатов, связанных с высокой компетентностью эмбриона к развитию (M.C. Summers и J.D. Biggers, 2003; A. El-Sayed с соавт., 2006). Молекулярно-генетические технологии позволяют исследовать весь набор генов, которые обеспечивают устойчивое развитие бластоцисты (A.M. Zolini с соавт., 2020), а также эпигенетические изменения паттернов экспрессии генов в разные моменты времени до и после имплантации эмбриона (A. Gad с соавт., 2012; P. Humblot, 2018). Это открывает перспективы для разработки методов маркер-ориентированной диагностики нарушений эмбрионального развития, а также методов регуляции экспрессии эмбриональных генов, что внесет вклад в повышение стельности у генетически ценных коров и приведет к увеличению темпов генетического прогресса в популяциях молочного скота.
Бесплатно
Статья научная
Развитие современного сельского хозяйства направлено на получение стабильно высоких урожаев и производство семян высокого качества. В связи с этим разрабатываются прецизионные агротехнологии, выравнивающие почвенные условия. Индивидуальные фенотипические характеристики растений определяются локальными почвенными условиями вблизи корневых систем. Так, дисперсия высот растений зависит от пространственного распределения энергетических ресурсов и питательных веществ в почве и ограничивается генетической нормой. Она может уменьшаться, когда почвенные условия выравниваются. Мы предположили, что эффект микробиологического выравнивания почвенных условий (МВПУ) наблюдается при деструкции растительных остатков с использованием микробного препарата. До настоящего времени исследования в этом направлении не проводились. В представленной работе были получены практически значимые результаты благодаря использованию оригинального фрактального анализа молекулярно-генетических частотных данных для почвенных микробных сообществ. Нашей целью стало экспериментальное и теоретическое изучение МВПУ эффекта, возникающего после деструкции растительных остатков с использованием микробных препаратов, разработанных во Всероссийском НИИ сельскохозяйственной микробиологии. В I опыте (2011-2014 годы) изучали дисперсию высот растений ячменя после деструкции соломы ячменя препаратом баркон. Во II опыте использовали данные молекулярно-генетического анализа почвенных микробных сообществ после деструкции растительных остатков тремя микробными препаратами (баркон, багс и омуг). Препарат баркон содержал консорциум бактерий и грибов; багс представлял собой консорциум целлюлозолитических микроорганизмов, полученный на основе биологически активного грунта; омуг - микробное удобрение, полученное после биотехнологической переработки птичьего помета. Функциональную активность микробных сетей, возникающих при деструкции растительных остатков с использованием микробных препаратов, изучили с помощью фрактального анализа молекулярно-генети-ческих данных микробных сообществ в почве. Мы получили фрактальный таксономический портрет микробных сообществ и индекс эффективности функционирования микробных сетевых образований, которые были сформированы во время деструкции растительных остатков. Использование баркона для деструкции растительных остатков в I опыте привело к постепенному выравниванию почвенных условий и уменьшению дисперсии высот растений. Без применения препарата дисперсия высот растений возрастала с каждым годом. Следовательно, микробные препараты могут инициировать эффективные микробные сети, которые способны сохранить энергетические ресурсы и питательные вещества, распределив их равномерно в почве. Молекулярно-генетические данные II опыта подтвердили, что эффективность функционирования микробных сетей после использования баркона, багса и омуга значительно увеличивалась за счет лучшей организации деструктивных процессов. Таким образом, деструкция растительных остатков с помощью биопрепаратов - необходимое и эффективное дополнение современных агротехнологий. Она приводит к восстановлению необходимого количества энергетических ресурсов и питательных веществ в почве, выравниванию ресурсов в почвенном пространстве, повышению устойчивости урожайности и улучшению качества получаемой растительной продукции.
Бесплатно
Статья научная
В контролируемых условиях при интенсивности ФАР 800-1300 Вт/м2 проводили индивидуальный отбор растений пшеницы сортопопуляции образца ¹ 232 по признаку «максимальная озерненностъ колоса». Определяли площадь поверхности листьев каждого яруса, продуктивность и спектр глиадинов.
Бесплатно
Статья научная
Несмотря на значительную экономическую выгоду при выращивании вьетнамского женьшеня ( Panax vietnamensis Ha et Grushv.), или женьшеня Ngoc Linh, в качестве лекарственного растения, масштабы его культивирования не расширяются из-за ограниченного количества посадочного материала. Предприняты значительные исследовательские усилия по разработке систем культуры тканей у вьетнамского женьшеня, однако его микроразмножение все еще сопряжено с трудностями. Нами предложен протокол микроразмножения вьетнамского женьшеня посредством соматического эмбриогенеза in vitro в культуре незрелых зиготических зародышей. Частота прямого соматического эмбриогенеза из незрелых зиготических зародышей на основной среде Schenk и Hildebrandt (SH) с 7 % сахарозы составила 44,33 %. Вторичный соматический эмбриогенез с коэффициентом пролиферации 26,71 индуцировали в жидкой культуре с встряхиванием в течение 4 нед в среде 1/2 SH с кинетином (0,1 мг/л) и тидиазуроном (0,1 мг/л). Среда SH с добавлением a-нафтилуксусной кислоты (НУК, 1 мг/л), 6-бензиладенина (6-БАП, 0,5 мг/л) и гибберелловой кислоты (5 мг/л) стимулировала прорастание соматических зародышей и раннее образование микроризомов. Далее у двух 10-недельных культур на среде SH с НУК (0,5 мг/л), 6-БАП (1 мг/л) и 4 % сахарозы в результате микроразмножения были получены проростки с хорошо развитой корневой системой и утолщенным микроризомом со спящей почкой. Акклиматизация микроразмноженных проростков, высаженных почву, состоящую из смеси лесного перегноя с песком в соотношении 1:2, прошла успешно с выживаемостью 91,67 %. Таким образом, для женьшеня Ngoc Linh разработан эффективный протокол микроразмножения на основе культуры in vitro незрелых зиготических зародышей, который состоит из пяти этапов, включая индукцию эмбриогенеза, пролиферацию соматических зародышей, прорастание соматических зародышей, развитие проростков и акклиматизацию проростков.
Бесплатно
Статья научная
В травостоях многолетних кормовых бобовых трав предпочтение отдается люцерне для создания культурных пастбищ и восстановления деградированных почв. Люцерна изменчивая ( Medicago sativa L. nothosubsp. varia (Martyn) Arcang) высокоурожайная и устойчивая к неблагоприятным условиям возделывания культура, что важно для зон рискованного земледелия России. Урожайность люцерны в значительной степени зависит от успешности формирования растительно-микробной симбиотической системы с клубеньковыми бактериями (ризобиями), которая становится способной фиксировать азот атмосферы. Согласно современным исследованиям по симбиогенетике, эффективность симбиотических систем предопределяется комплементарностью взаимодействия геномов растения и его микросимбионта. Исходя из этого и биопрепараты, которые используют для обработки семян бобовых, также должны содержать селекционно подобранные штаммы ризобий с соответствующими генотипическими характеристиками. В представленной работе впервые проведен сравнительный анализ урожайности 73 сорто-микробных систем, сформированных на основе штаммов Sinorhizobium meliloti , выделенных из района, подверженного засолению, и производственных штаммов 425а и 415б, которые используют для приготовления биопрепарата Ризоторфин, с сортами люцерны, созданными методами традиционной и сопряженной селекции. Показана перспективность отбора высокоэффективных штаммов, комплементарных хозяйственно-ценным сортам растений-хозяев в модельных опытах. Установлено, что штаммы А1 и А2 активнее формировали симбиотические системы с испытанными сортами люцерны, чем производственные штаммы. Впервые показано, что сорто-микробные системы на основе новых сортов обладают повышенной адаптивностью, а потенциал повышения прибавок урожая для них существенно превышает 50 %. Впервые получены данные, показывающие, что урожайность сорто-микробных систем, сформированных производственным штаммом 425а, преимущественно зависит от неконтролируемых факторов согласно двухфакторному дисперсионному анализу. Вместе с тем, геномные характеристики этого штамма играют более существенную роль, чем сорто-штаммовые взаимодействия, в формировании урожая, что, по-видимому, обуславливает востребованность биопрепаратов на основе этого штамма для разных сортов в различных географических районах Российской Федерации. Высокая комплементарность штаммов А1 и А2 к сорту Агния и функциональная значимость генетических характеристик штамма 425а обусловили интерес к их геномным характеристикам. Сравнительный анализ геномов с использованием ДНК-биочипов выявил существенные различия между высокоэффективными штаммами. Установлено, что гены, обуславливающие симбиотическую активность и стрессоустойчивость ризобий, имели дивергентную структуру преимущественно у штаммов, адаптированных к условиям засоления. Данные первых этапов молекулярно-генетического анализа высокоэффективных штаммов указывают на необходимость продолжения исследований, которые позволят осуществлять направленный подбор штаммов-микросимбионтов для современных сортов люцерны. Впервые представленные результаты оценки урожайности сорто-микробных систем, выращиваемых в различных природно-климатических условиях России, наглядно доказывают необходимость широкого внедрения метода сопряженной симбиотической селекции для создания новых хозяйственно ценных сортов бобовых трав, необходимых для формирования устойчивой кормовой базы.
Бесплатно
Статья научная
Респираторные болезни молодняка крупного рогатого скота причиняют значительный экономический ущерб животноводству. В этиологии этих болезней существенная роль принадлежит бактерии Pasteurella multocida, у которой выявлено 5 капсульных групп (A, B, D, E, F), имеющих разное эпизоотологическое значение. Идентификация бактерий, основанная на результатах изучения их культурально-морфологических и биохимических свойств, - трудоемкий и длительный процесс. Методы молекулярной биологии, в частности полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяют быстро обнаружить и идентифицировать микроорганизмы непосредственно в пробах биологического материала, смешанных или чистых культурах. Целью нашего исследования стала разработка и изучение эффективности мультиплексной ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени для выявления культур Pasteurella multocida и генотипирования пяти капсульных групп (A, B, D, E, F). В работе использовали референтные штаммы P. multocida (1231, 681 и Т80), культуры бактерий, выделенные от больных животных в 2013-2014 годах, а также 260 проб биоматериала (легкие, селезенка, средостенные и бронхиальные лимфатические узлы), отобранных от павших телят в возрасте от 4 сут до 6 мес с признаками респираторных болезней. Олигонуклеотидные праймеры и зонды были разработаны на высококонсервативный ген кmt1 и гены локуса капсульного синтеза (hyaD, fcbD, dcbF, bcbD и ecbJ ), специфичные для капсульных групп. Для проверки чувствительности реакции использовали разработанные положительные контрольные образцы и суспензии культур референтных штаммов и изолятов. Специфичность реакции подтверждали секвенированием ампликонов. Чувствительность выявления ДНК бактерии для разных групп составила от 1,6·10 до 5,9·102 геномных эквивалентов на реакцию, неспецифических реакций не наблюдали. Диагностическая чувствительность разработанного метода составила при исследовании чистых культур 103 КОЕ/мл, при исследовании биологического материала - 105 КОЕ/г. Методом ПЦР типировали 11 культур бактерий, ранее охарактеризованных серологически и бактериологически, относящихся к капсульным группам А, В и D. Анализ последовательности гена kmt1 подтвердил результаты ПЦР. При исследовании 260 проб биоматериала от больных животных обнаружили Pasteurella multocida в 63,3 % проб легких, 42,6 % - лимфатических узлов, 8,8 % - селезенки. Не установлена циркуляция среди восприимчивого поголовья животных бактерии Pasteurella multocida генотипов В и Е. В большинстве исследованных проб были выявлены генотипы А, реже - D, в одном случае - F.
Бесплатно
Выявление антител, специфичных к энтеротоксинам стафилококков, в сыворотке крови и молозиве коров
Статья научная
Мастит - распространенное инфекционное заболевание молочного скота, наносящее существенный экономический ущерб животноводству и влияющее на качество молочной продукции. Основной возбудитель мастита крупного рогатого скота (КРС) - золотистый стафилококк ( Staphylococcus aureus ). Заражение молочной железы S. aureus остается серьезной проблемой для всех стран мира. Болезнетворные свойства S. aureus и устойчивость в организме хозяина определяются набором токсинов. Микроорганизм продуцирует патогенные факторы, которые оказывают значительно влияние на течение заболевания. В настоящее время не существует эффективного способа борьбы с маститом, поэтому исследования иммунного статуса коров по отношению к энтеротоксинам стафилококка актуальны. Цель нашей работы заключалась в выявлении и определении титров антител, специфичных к наиболее распространенным энтеротоксинам стафилококков A, B, C, D, E, G, H, I и TSST, в сыворотке крови и молозиве коров ( Bos taurus taurus ). Объектом исследований были животные голштинизированной черно-пестрой породы второй лактации ( n = 47, 2016 год), которые находились на беспривязном содержании в хозяйстве Калужской области и 2 раза в год подвергались иммунизации вакциной Mastivak («Laboratorios Ovejero S.A.», Испания). Кровь отбирали из хвостовой вены (с последующим центрифугированием для осаждения форменных элементов), молозиво и молоко - непосредственно после доения из всех долей вымени в стерильные флаконы с соблюдением правил асептики. Наличие и титр Ig к энтеротоксинам A, B, C, D, E, G, H, I и TSST стафилококков оценивали методом непрямого иммуноферментного анализа. В 53,19 % образцов сывороток детектировались антитела класса G (IgG), специфичные к SEH. Антитела к TSST обнаружены в 4,26 % образцов, при этом их титр был самым низким по сравнению с антителами к другим энтеротоксинам. Антитела к SEB, SED, SEE, SEG, SEI и TSST вывили соответственно у 10,64; 23,47; 31,91; 29,78; 34,04 и 4,26 % животных. Анализ секретов молочной железы показал наличия в молозиве IgA к SEH, SEG и SEI. IgA к SEA, SEB, SEC, SED, SEE, TSST обнаружены не были. В молоке антитела к энтеротоксинам не выявляли. Таким образом, в сыворотке крови и молозиве клинически здоровых коров голштинизированной черно-пестрой породы установлено наличие антител к стафилококковым энтеротоксинам SEA, SEB, SEC, SED, SEE, SEG, SEH, SEI и TSST, то есть животные могли иметь контакт со стафилококками, продуцирующими такие типы токсинов.
Бесплатно
Выявление анцестральных характеристик генома у Rhizobium leguminosarum bv. Trifolii
Статья научная
Клубеньковые бактерии вида Rhizobium leguminosarum - симбиотические азотфиксаторы, разделяющиеся на два биотипа: viciae и trifolii (D.C. Jordan с соавт., 1984). За функцию симбиотической азотофиксации отвечают симбиотические гены, эволюция которых зависит от растений-хозяев (J.P.W. Young с соавт., 1989). Недавно было показано, что по типу организации симбиотических регионов геномов ризобии, выделенные из вавиловии красивой Vavilovia formosa (Stev.) Fed . , возможно, близки к протосимбионту трибы FabeaeR. leguminosarum bv. viceae (E.R. Chirak с соавт., 2019; A.K. Kimeklis с соавт., 2019). Однако в эволюции R. leguminosarum имела место еще одна более ранняя дивергенция между биотипами viceae и trifolii, отправной точкой которой был протосимбионт всего вида R. leguminosarum , существовавший до его разделения на биовары. В своей работе мы представляем результаты секвенирования группы геномов R. leguminosarum bv. trifolii и сопоставления структуры их симбиотических регионов с соответствующими участками геномов R. leguminosarum bv. viciae , относящихся к анцестральным и «продвинутым» типам. Для этого мы сравнили полные геномы штаммов R. leguminosarum bv. trifolii (методика секвенирования Oxford Nanopore) и референсных штаммов R. leguminosarum bv. viceae , относящихся к анцестральным и «продвинутым» типам. Было показано, что в геномах штаммов симбионтов клевера находятся четыре из пяти анцестральных признаков: увеличенный размер межгенных областей в симбиотическом регионе, наличие в nod -опероне гена nodX , отсутствие гена nodT в sym -регионе и только одна копия оперона fixNOPQ , располагающаяся на плазмиде pSym. Исходя из полученных результатов, мы предполагаем, что протосимбионт R. leguminosarum мог быть также близок к ризобиям клевера, как и к ризобиям вавиловии.
Бесплатно
Выявление вирусалейкоза птиц подгруппы К в России и его молекулярно-генетический анализ
Статья научная
Вирус лейкоза птиц (ВЛП) принадлежит к роду Alpharetrovirus семейства Retroviridae. Геном вируса представлен одноцепочечной РНК длиной более 7 тыс. нуклеотидов. У кур описаны подгруппы ВЛП A, B, C, D, J, K и E. Их классифицируют по антигенам белка оболочки GP85. ВЛП широко распространен по всем миру, вызывает различные патологии, снижает продуктивность и наносит огромный ущерб промышленному птицеводству. ВЛП подгруппы К был впервые обнаружен в странах Азии. Исследования превалентности ВЛП подгруппы К немногочисленны и на территории России ранее не проводились. Нашей целью было изучение распространения ВЛП этой подгруппы у кур из российских птицеводческих хозяйств с использованием тест-системы, разработанной для идентификации генома ВЛП подгруппы К методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), и анализ свойств ВЛП подгруппы К. Испытание тест-системы проводили на 5292 образцах ДНК кур отечественного мясного кросса бройлерного типа из хозяйства Московской области и у кур мясных и яичных пород из хозяйств в разных регионах России...
Бесплатно
Статья научная
Согласно данным официальной статистики, в России ежегодно производится около 130 млн т продукции зерновых колосовых культур. В Едином Перечне карантинных объектов Евразийского экономического союза находится возбудитель желтого слизистого бактериоза пшеницы Rathayibacter tritici . Указанный вид подлежит выявлению при импорте и, при наличии требований импортера, при экспорте пшеницы. В связи с необходимостью регулирования в карантинных фитосанитарных лабораториях для Rathayibacter tritici имеется диагностическая методика. Для других возбудителей бактериозов зерновых культур, таких как Rathayibacter rathayi , Pseudomonas fuscovaginae , Pseudomonas cichorii, Pseudomonas fluorescens , Pseudomonas syringae, Acidovorax avenae, Erwinia rhapontici , Xanthomonas translucens , Clavibacter tessellarius и других, диагностические методики отсутствуют, поэтому обнаружения в практике работы диагностических фитосанитарных лабораторий не зафиксированы. Перечисленные виды регулируются странами-импортерами, закупающими в России более половины всей предназначенной для экспорта зерновой продукции. Бактериозы представляют серьезную угрозу производству зерна, а причиняемый ими возможный ущерб урожаю оценивается в 10-40 %. Бактерии могут вызывать вспышки заболеваний или находиться в растениях в скрытой форме в зависимости от условий окружающей среды и почти никогда не вызывают симптомов на зерне. В связи с этим обнаружить возбудителей бактериозов можно только в лаборатории, используя метод посева на питательные среды, проведение которого зачастую занимает неделю и более. Достоверная идентификация каждого вида бактерий, колонии которых получены в результате посева, возможна только с использованием молекулярных методов. Требуется разработка ПЦР-тестов, позволяющих проводить идентификацию целевых бактерий напрямую в образцах, не применяя культуральный метод, что существенно упростит и ускорит процедуру подтверждения соответствия состояния партий российского зерна требованиям импортеров. Разработка молекулярных методов диагностики возбудителей бактериозов зерновых культур возможна только после изучения их видового состава в растениях и зерне, при этом в вегетирующих растениях разнообразие живых бактерий существенно выше, чем в зерне. Информация о видовом составе бактерий на зерновых культурах позволит с применением геномного анализа обнаружить видоспецифичные ПЦР-мишени и разработать диагностические ПЦР-тесты для быстрой идентификации особо опасных и значимых для экспорта зерна видов бактерий. Ранее масштабного изучения бактериального состава в зерновых культурах не проводили, в связи с чем список бактерий, которые могут находиться вместе в одном образце, отсутствует. Отсутствует и полный перечень всех бактерий, которые можно встретить в зерновых культурах. В то же время для биоинформатического предсказания видоспецифичной ПЦР-мишени необходимо знать все виды, которые можно встретить в анализируемом образце, от которых следует отличать целевой вид. Состав бактериальной микробиоты может различаться в зависимости от культуры и сорта, поэтому максимальное разнообразие различных культур и сортов позволит получить более полную информацию. Влажные и умеренно теплые условия летнего периода в Центральном регионе России идеально подходят для развития бактериозов, поэтому сбор образцов мы проводили на территории Тимирязевской полевой опытной станции (г. Москва), где ежегодно ведутся работы по гибридизации, селекции и сортоиспытанию нескольких сотен сортов зерновых культур. Работа посвящена выявлению и идентификации бактерий в образцах зерновых культур Тимирязевской полевой опытной станции (г. Москва). Объектами исследования были бактериальные изоляты, выделенные из образцов зерновых культур в 2020 году. Идентификацию бактерий проводили посредством секвенирования ампликонов, полученных в результате ПЦР с парами праймеров PSF/PSR, SyD1/SyD2 и 8UA/519B и сравнения полученных последовательностей с помощью сервиса BLAST с последовательностями, размещенными в GenBank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov). В результате собраны 55 образцов зерновых культур, выделен и идентифицирован 171 бактериальный изолят, в том числе до вида идентифицированы 34 изолята. Бактериальное разнообразие представлено 14 видами. Среди них - фитопатогены Pantoea ananatis , Clavibacter michiganensis , Rhodococcus fascians , Pseudomonas trivialis , Pseudomonas viridiflava и Pseudomonas syringae . Наибольшая частота встречаемости - 70,9 % отмечена у видов, относящихся к роду Pseudomonas . Также высокой частотой встречаемости характеризуются представители родов Frigoribacterium (36,4 %), Clavibacter (16,4 %), Arthrobacter (12,7 %) и Rhodococcus (10,9 %). Результаты проведенного исследования могут быть использованы при разработке быстрых и достоверных способов диагностики особо опасных и значимых для экспорта зерна видов бактерий.
Бесплатно
Выявление и генетическая идентификация Mycoplasma sp. 1220 у гусей в Российской Федерации и Украине
Статья научная
Исследовали пробы патологического материала от 47 домашних гусей с клиническими признаками воспаления фаллоса, клоаки и яйцевода из двух гусеводческих хозяйств России и одного гусеводческого хозяйства Украины. Известно, что у кур подобная клиническая картина может быть вызвана Mycoplasma gallisepticum, у гусей - при инфицировании условно-патогенными микроорганизмами родов Neisseria и Candida, а также Mycoplasma sp. 1220 (недавно охарактеризованная условно-патогенная микоплазма). С использованием ПЦР мы не выявили M. gallisepticum у исследуемой птицы. В то же время в образцах были обнаружены специфические ампликоны генов rpoB, dnaE, fusA, pyk Mycoplasma sp. 1220. Результаты секвенирования этих ампликонов продемонстрировали 98-99 % их гомологии с последовательностями из GenBank для Mycoplasma sp. 1220 - микоплазмы, выделенной и идентифицированной ранее в Венгрии у домашних гусей с клиническим проявлением патологии органов репродуктивной системы (видовое название микроорганизму пока не присвоено). Выполненное исследование представляет собой первый случай выявления и генетической идентификации Mycoplasma sp. 1220 у домашних гусей на территории Российской Федерации и Украины.
Бесплатно
Статья научная
Респираторные болезни крупного рогатого скота (КРС) широко распространены во всех странах с развитым животноводством и наносят значительный экономический ущерб. Часто они являются результатом синергического взаимодействия нескольких вирусов и бактерий, преимущественно семейства Pasteurellaceae . Клинические признаки и патологоанатомические изменения внутренних органов зависят от наличия или отсутствия того или иного возбудителя. Массовые вспышки возникают при объединении животных из разных источников. Этиологическая структура таких вспышек достаточно изучена, однако данных, касающихся особенностей распределения бактерий и вирусов в органах респираторного тракта и их количественного определения, недостаточно. Нами представлены результаты изучения этиологической структуры вспышки респираторных болезней в условиях молочного комплекса после ввода КРС из-за рубежа, во время которой пало более 400 животных разных половозрастных групп. Исследовали пробы внутренних органов 58 павших животных разного возраста. При изучении этиологической структуры вспышки использовали стандартные бактериологические методы, вирусные агенты идентифицировали в ПЦР методом гель-электрофореза, а для количественной оценки всех обнаруженных инфекционных агентов применили ПЦР в режиме реального времени. Всего выявили 9 вирусов и бактерий, из которых респираторно-синцитиальный вирус КРС (BRSV, Bovine Respiratory Syncytial Virus, род Pneumovirus , семейство Paramyxoviridae ) и бактерии семейства Pasteurellaceae играли ведущую этиологическую роль. С использованием количественной ПЦР определили концентрации вируса и бактерий Pasteurella multocida и Mannheimia haemolytica в органах респираторного тракта 13 телят разного возраста со сходными клиническими признаками, патологоанатомическими изменениями и присутствием в органах респираторного тракта трех возбудителей. Концентрация агентов составляла от 0,1±0,03 до 4,8±0,47 log10 геномных эквивалентов (ГЭ)/мл для BRSV, от 1,3±0,60 до 4,1±0,30 log10 ГЭ/мл для P. multocida и от 1,9±0,03 до 4,9±0,67 log10 ГЭ/мл для М. haemolytica . Концентрация и распространение возбудителей по органам у телят разных возрастов различались. BRSV выявили в более широком диапазоне органов дыхания как свободных от бактерий, так и колонизированных ими. В легких концентрация вируса была выше, чем в трахеальном и бронхиальном экссудате. P. multocida присутствовала только в верхних и средних долях легких у 2,5-4-месячных телят в приблизительно равных концентрациях при острой форме бронхопневмонии. Степень колонизации легких этой бактерией повышалась с возрастом, и у телят в возрасте 6 мес ее численность достигала максимальных значений в верхних и средних долях легких, легочных лимфатических узлах и смывах со слизистых оболочек при хронической бронхопневмонии. M. haemolytica выявляли при острой форме бронхопневмонии у телят в возрасте 2,5 мес в минимальном количестве в средних долях легких, в максимальном - в трахеальном и бронхиальном экссудатах. Результаты показали, что вирус и бактерии размножаются в различных частях легких, не подавляя друг друга, что подтверждает эффект их синергического взаимодействия и приводит к усилению тяжести течения пневмонии. Количественная оценка вирусов и бактерий методом ПЦР в режиме реального времени может быть полезным инструментом для изучения патогенеза смешанных вирусно-бактериальных инфекций в естественных условиях. Полученные результаты подчеркивают роль вируса в возникновении легочного пастереллеза.
Бесплатно
Статья научная
Микроорганизм Histophilus somni (сем. Pasteurellaceae ) часто встречается у крупного рогатого скота (КРС), осложняет течение респираторных вирусных заболеваний и может вызывать мультисистемное заболевание, известное как гистофилез. Для лечения заболеваний, вызванных микроорганизмами семейства Pasteurellaceae , наиболее часто применяются аминогликозиды, сульфаниламиды, бета-лактамы, тетрациклины и макролиды, в связи с чем можно ожидать формирование устойчивости H. somni к препаратам этих групп. В настоящей работе впервые охарактеризована устойчивость к антимикробным препаратам изолятов H. somni , выделенных от КРС на территории Российской Федерации. Впервые установлена циркуляция резистентных штаммов H. somni в российских животноводческих хозяйствах. Нашей целью было изучение антибиотикорезистентности циркулирующих штаммов Histophilus somni с помощью фенотипических и генотипических методов и оценка возможности использования ПЦР для прогнозирования устойчивости H. somni к антимикробным средствам нескольких групп. Молекулярно-генетическое определение антибиотикорезистентности проводилось на основе идентификации генов blaOXA-2, sul2, strA, strB, aadA25, aphA1, tetH. В работе использовали культуры H. somni , выделенные в 2018-2019 годах из биологического материала (паренхиматозные органы, смывы, сперма) крупного рогатого скота разных пород, возрастных, половых и физиологических групп (всего 145 животных). Чувствительность изолятов H. somni к 13 антибактериальным препаратам, относящимся к 4 классам (аминогликозидам, бета-лактамам, тетрациклинам и сульфаниламидам), тестировали диско-диффузионным методом. ДНК выделяли из культур H. somni и использовали для выявления генетических детерминант устойчивости к антибиотикам. Изоляты H. somni были протестированы на наличие семи генов устойчивости к антибиотикам ( tetH , blaOXA-2 , aadA25 , strA , strB , aphA1 , sul2 ) методом ПЦР с электрофоретической детекцией и гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени. Всего были выделены и идентифицированы 18 изолятов H . somni , при этом вырастить в достаточном количестве и оценить на чувствительность к антибиотикам удалось лишь 12 образцов. Наибольшую фенотипическую устойчивость выявили к аминогликозидам: резистентность к стрептомицину составляла 50 %, а устойчивость к неомицину превышала 40 %. У устойчивых образцов были обнаружены гены резистентности aadA25 , strA , strB и aphA1 . Резистентность к сульфаниламидам также оказалась велика и была выявлена у 33 % образцов, в каждом из которых методом ПЦР идентифицировали ген устойчивости sul2 . По результатам микробиологического исследования чувствительность к пенициллинам составила 75 %, к цефалоспоринам приближалась к 100 %. Чувствительность к препаратам группы тетрациклинов оказалась выше 80 %. При этом гены устойчивости к тетрациклинам ( tetH ) и пенициллинам ( blaOXA-2 ) обнаружены не были. По-видимому, устойчивость образцов была обусловлена другими механизмами резистентности. Мультирезистентными оказались два изолята H. somni : они проявляли устойчивость к препаратам классов аминогликозидов, бета-лактамов и тетрациклинов. Четыре образца показали устойчивость к препаратам сразу двух различных групп антибиотиков: два образца - к аминогликозидам и сульфаниламидам (в них были идентифицированы гены strA , strB , aadA25 , aphA1 и sul2 ), два образца - к аминогликозидам и бета-лактамам (у них обнаружили только гены устойчивости к аминогликозидам aadA25 и strA ). За исключением образцов, устойчивых к тетрациклинам и пенициллинам, в которых не были выявлены ожидаемые генетические детерминанты резистентности, все наблюдаемые фенотипы устойчивости к противомикробным препаратам соответствовали результатам ПЦР-исследования. Сочетание генотипического и фенотипического методов определения антибиотикорезистентности способствует лучшему пониманию механизмов устойчивости бактерий к антимикробным препаратам, а также позволяет повысить эффективность мониторинга антибиотикорезистентности микроорганизмов, выделяемых от продуктивных животных.
Бесплатно
Краткое сообщение
Провели сравнительное изучение сортов-популяций, полусибсовых потомств и инбредных линий озимой ржи по вязкости водного экстракта зерна. Проанализировали зависимость этого признака от погодных условий сезона вегетации и его связь с другими признаками качества зерна. Оценили значение вязкости как показателя хлебопекарных качеств зерна ржи, а также долю генотипической дисперсии признака в общей фенотипической дисперсии.
Бесплатно
