Статьи журнала - Сельскохозяйственная биология
Все статьи: 1731
Статья научная
Биогербициды должны проявлять стабильную эффективность в полевых условиях, обладать специфичностью и скоростью действия, быть совместимыми с другими препаратами и востребованными на рынке. Основой микогербицидов может служить как мицелий, так и конидии фитопатогенных грибов. Мицелий менее устойчив к сушке, чем конидии. В то же время технологический процесс получения конидий зачастую сложнее, а эффективность в полевых условиях менее стабильна, чем у мицелия. Фитопатогенный гриб Stagonospora cirsii J.J. Davis, вызывающий заболевание пятнистости листьев у корнеотпрысковых сорных растений семейства Asteraceae, рассматривается как потенциальный микогербицид, предназначенный для борьбы с бодяком полевым Cirsium arvense (L.) Scop. В настоящей работе мы впервые показали, что, манипулируя составом жидкой питательной среды, можно существенно повысить патогенность мицелия гриба S. cirsii и его толерантность к высушиванию. Цель исследования - получить высокий выход вирулентного мицелия S...
Бесплатно
Получение гаплоидных растений Rubus arcticus L. методом культуры микроспор in vitro
Статья научная
Княженика арктическая ( Rubus arcticus L.) - ценная ягодная культура, которая используется в качестве плантационной культуры относительно короткое время. Княженика арктическая служит донором ремонтантности при межвидовой гибридизации с Rubus idaeus L., однако передает потомству низкую урожайность. Основное направление селекции R. arcticus - повышение урожайности растений, в связи с чем особое значение имеет ускорение селекционного процесса. Добиться этого можно, используя растения с удвоенным гаплоидным набором хромосом. В настоящей работе нами впервые были получены гаплоидные растения-регенеранты R. arcticus в культуре микроспор, подобрана концентрация 6-бензиламинопурина и источник углеводного питания для индукции эмбриоидогенеза. Цель нашего исследования состояла в разработке методики получения гаплоидных растений Rubus arcticus в культуре микроспор. В опытах использовали сорта княженики арктической, выведенные селекционерами в Финляндии (Pima, Mespi) и Швеции (Astra)...
Бесплатно
Статья научная
Криоконсервирование репродуктивных клеток самцов рыб - актуальное направление в стратегии сохранения генетического биоразнообразия и в аквакультуре. Жизнеспособность криоконсервированной спермы обычно подтверждают оплодотворением яйцеклеток рыб в лабораторных условиях, но дальнейших наблюдений за полученной молодью не проводят. В настоящем исследовании впервые проанализированы поведенческие реакции предличинок, личинок и молоди русского осетра ( Acipenser gueldenstaedtii von Brandt & Ratzeburg 1833) при использовании размороженной спермы для оплодотворения икры и доказана физиологическая полноценность развивающихся особей. Икру получали в производственных условиях от самки русского осетра массой 20 кг и длиной 142 см, рабочая плодовитость - 229500 икринок. Одну часть икры оплодотворили размороженной спермой русского осетра, хранившейся в криобанке 2 года, другую - нативной спермой по стандартной заводской технологии (контроль). Вылупившихся предличинок учитывали сплошным поштучным методом...
Бесплатно
Статья научная
В основе развития бобово-ризобиального симбиоза лежит сигнальный обмен между партнерами, что обеспечивает их взаимное узнавание, активацию инфекционного процесса и программы органогенеза клубеньков. Интерес представляет изучение возможности приобретения небобовыми растениями способности к рецепции сигнальных молекул ризобий - липохитоолигосахаридных сигналов Nod-факторов и дальнейшей трансдукции сигнала. У гороха ранее были выявлены две рецепторные киназы - SYM10 и K1, которые необходимы для узнавания Nod-факторов при инициации симбиоза с ризобиями. При рецепции Nod-факторов формируется комплекс между этими двумя рецепторными киназами, что приводит к сигнальной трансдукции. В настоящей работе был осуществлен перенос двух генов, кодирующих LysM-РПК SYM10 и K1 у гороха Pisum sativum L., в растения томата Solanumlycopersicum L. с помощью агробактериальной трансформации. У композитных растений, трансформированных генами PsSym10 или PsK1 , впервые выявлена возможность активации экспрессии перенесенных генов рецепторов под влиянием инокуляции типовым штаммом ризобий Rhizobiumleguminosarum bv. viciae CIAM1026. Также показано, что под влиянием рецепторов в генетически трансформированных корнях композитных растений увеличивается экспрессия генов, которые могут регулироваться компонентами «общего» сигнального пути. Целью работы было изучение возможности приобретения растениями S. lycopersicum способности к узнаванию сигнальных молекул ризобий за счет переноса генов, кодирующих рецепторы Nod-факторов у бобового растения P. sativum . Для проведения экспериментов были получены и использованы два вида конструкций в векторе pKm43GW, в которых гены рецепторов PsSym10 или PsK1 были клонированы под промотором гена экстенсина томата pSlEXT1 - pSlEXT1:: PsSym10-3xFLAG ::T35S и pSlEXT1:: PsK1-RFP ::T35S. Молодые проростки томата S. lycopersicum сорта Carmello были трансформированы штаммом Agrobacterium rhizogenes Arqua 1. Трансформированные проростки помещали на агаризованную среду Мурасиге-Скуга (MC) без сахарозы в чашках Петри и культивировали в вертикальном положении в фитотроне до появления каллуса. После этого растения переносили на среду МС c 3 % cахарозы, содержащую 0,3 мг/мл антибиотика цефотаксима, и инкубировали до появления трансгенных корней. Композитные растения переносили в вермикулит, политый 0,5½ средой Fahreus и инкубировали в условиях повышенной влажности в течение 2-3 сут. После этого растения были инокулированы штаммом R. legumi-nosarum bv. viciae CIAM1026, содержащим ген глюкуронидазы uidA ( GUS ). Для анализа использовали трансформированные корни композитных растений томата без инокуляции ризобиями (контроль, 7 сут), а также трансформированные корни через 7 и 21 сут после инокуляции. Количественный анализ экспрессии генов проводили методом количественной ПЦР, совмещенной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). При использовании промотора pSlEXT1 наблюдали экспрессию обоих генов PsSym10 и PsK1 в генетически трансформированных корнях растений томата, при этом экспрессия усиливалась под влиянием инокуляции ризобиями. Было показано существенное (примерно в 2,0-2,5 раза) повышение экспрессии гена PsSym10 в ответ на инокуляцию ризобиями как на 7-е, так и на 21-е сут. Уровень экспрессия PsK1 оказался самым высоким через 7 сут после инокуляции в трансформированных корнях композитных растений томата по сравнению с контролем. Чтобы определить, будут ли активироваться компоненты «общего» сигнального пути под влиянием перенесенных рецепторов в композитных растениях томата, были оценены изменения в экспрессии генов S. lycopersicum SlD27 , SlNSP2 , SlRAM1 и SlMAPK6 . Эти гены кодируют каротиноид-изомеразу (DWARF27), регулирующую синтез гормонов стриголактонов, транскрипционные факторы NSP2 и RAM1, а также митоген-активируемую протеинкиназу (MAPK6). Активация экспрессии двух генов SlNSP2 и SlMAPK6 в ответ на инокуляцию может свидетельствовать о влиянии перенесенного гена K1 гороха на восприимчивость растений томата к инокуляции ризобиями.
Бесплатно
Статья научная
Разрабатывали методику получения линии гибридных клеток, секретирующих моноклональные антитела, обладающие специфичностью к полипептидам вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней. Приведена характеристика моноклональных антител по активности в иммунологических реакциях и полипептидной специфичности.
Бесплатно
Статья научная
С использованием в качестве источника кариопластов клеток кумулюса коров определяли условия и режим проведения основных этапов клонирования: дозревания ооцитов in vitro; реконструирования клеток; слияния кариопласта с цитопластом; активации реконструированных клеток; культивирования реконструированных эмбрионов до стадии бластоци-сты. Реконструированные клетки активировали кальциевым ионофором с последующей обработкой 6-диметиламиноггурином через 0,5-1,5 ч после электрослияния и культивировали in vitro (в среде DMEM на фидерном слое из клеток кумулюса под газовой фазой 5% С02 в воздухе или в среде KSOM, обогащенной заменимыми и незаменимыми аминокислотами, под газовой фазой 5% С02, 5% 02, 90% N2). Разработанная технология позволяет получать 20,3-23,6 % клонированных эмбрионов крупного рогатого скота на стадии бластоцисты.
Бесплатно
Статья научная
Проводили межвидовые реципрокные скрещивания между четырьмя дикими видами перца (Capsicum L.). С использованием культуры зародышей in vitrо получили стерильные межвидовые гибриды C. frutescens × C. chinense. Выполнили цитологический анализ нарушений в развитии гамет у всех пяти растений гибридов F1 по стадиям развития микроспор и пыльцы. Для молекулярного анализа использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и праймеры, позволяющие амплифицировать SCAR-маркеры (sequence-characterized amplified region) цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС). Эти маркеры были идентифицированы у образца C. frutescens, использованного в качестве материнского компонента при скрещивании с C. chinense, а также у всех пяти растений стерильных гибридов F1.
Бесплатно
Получение многолетних трав, устойчивых к хлоридному засолению, с помощью клеточной селекции
Статья научная
Возможность возделывания культурных растений на засоленных землях определяется содержанием и химическим составом солей в корнеобитаемых слоях. Различают сульфатное, сульфатно-хлоридное, карбонатное, хлоридное засоление. Накопление хлорида натрия, хлорида магния и хлорида кальция отмечается как в почвах агроэкосистем, так и в городских условиях из-за использования этих соединений в качестве противогололедных реагентов. Формирование солонцеватости крайне неблагоприятно, поскольку препятствует развитию корневой системы. В настоящей работе мы получали растения овсяницы красной ( Festuca rubra L.) и полевицы побегоносной ( Agrostis stolonifera L.) in vitro, устойчивые к высоким концентрациям хлорида натрия. Фитотоксичность хлорида натрия, хлорида магния, хлорида кальция оценивали по всхожести семян и росту растений. По нашим данным, исходные растения полевицы и овсяницы демонстрируют повышенную чувствительность к засолению. На модифицированной среде Мурасиге-Скуга (MS) с 1 и 2 % NaCl были отобраны устойчивые клеточные линии овсяницы и полевицы. Для отбора солеустойчивых клеток каллусы (полевица - 2100, овсяница - 750) культивировали в течение двух пассажей на средах MS с добавлением 1 или 2 % NaCl. Регенерацию и укоренение растений из выживших клонов также проводили на средах MS с 1 и 2 % NaCl, затем регенеранты пересаживали в почву. В почве в вариантах c 1 и 2 % NaCl у полевицы укоренилось соответственно 132 и 18 растений, у овсяницы - 26 и 9. Для оценки солеустойчивости в почву вносили NaCl (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 %). У большинства образцов полевицы побегоносной и овсяницы красной этот признак реализовался на уровне целого растения. Показано наследование устойчивости к хлориду натрия и другим солям у полевицы побегоносной. Разработанный метод может быть использован для получения кормовых и городских трав, устойчивых к засолению.
Бесплатно
Статья научная
В последние годы наблюдается существенный прогресс в ветеринарной онкологии: разрабатываются новые методы диагностики и лечения онкологических заболеваний у животных, расширяется спектр возможных терапевтических мероприятий. Представляют интерес, в частности, перспективы создания ветеринарных лекарственных препаратов с использованием разнообразных наночастиц (в том числе, коллоидного селена), на поверхности которых иммобилизованы биологически активные вещества, обладающие противоопухолевым действием. Наночастицы селена проявляют цитотоксическое воздействие на опухолевые клетки и рассматриваются также в качестве эффективных носителей для адресной доставки in vivo лекарств, генетических материалов, белков и т.п. Хорошо «настраиваемые» поливалентные структуры поверхности селеновых наночастиц обеспечивают удобную платформу для интеграции нескольких терапевтических препаратов или биомакромолекул с ковалентным или нековалентным конъюгированием. Нами был синтезирован комплекс наночастиц селена с силимарином - гепатопротектором флавоноидного типа, выделяемым из плодов расторопши пятнистой Silybum marianum (L.) Gaertn., и оценена цитотоксичность полученного препарата для линий опухолевых клеток, различающихся происхождением и онкологическими свойствами. Методами электронной микроскопии и динамического рассеяния света установлено, что разработанная методика обеспечивает получение стабильных взвесей конъюгатов селеновых наночастиц с силимарином в диапазоне размеров порядка 20-40 нм. Показано, что полученный конъюгат проявляет ярко выраженный цитотоксический эффект в отношении линии опухолевых клеток Hep-2 с уменьшением количества жизнеспособных клеток примерно в 6,5 раза по сравнению с контролем, против уменьшения примерно 2,3 раза в отношении линии клеток SPEV-2. При этом препарат исходного коллоидного селена оказывал значительно более слабое воздействие на культуры клеток обоих типов, а чистый силимарин не проявлял статистически значимого влияния на клетки SPEV-2 (в отличие от Hep-2). Предполагается, что полученный препарат может быть использован в дальнейшем для разработки противораковых методик нового поколения и представляет интерес также с точки зрения реализации подходов на основе принципов «зеленой химии».
Бесплатно
Статья научная
Загрязнение микотоксинами наносит значительный экономический ущерб пищевой и кормовой промышленности и серьезно угрожает здоровью человека и животных из-за мутагенности, онкогенности и других опасных свойств этих вторичных метаболитов грибов. Метод ферментативной деградации является эффективной и экологически приемлемой альтернативой химическим методам деконтаминации сельскохозяйственного сырья и пищевой продукции. В проведенном нами исследовании система экспрессии рекомбинантных белков, которую мы адаптировали для повышения копийности дрожжевых гетерологичных генов в хромосоме дрожжей Pichia pastoris, была впервые применена для получения фермента ADTZ-оксидазы из Armillaria tabescens , разлагающей афлатоксин В1. Cинтетический ген adtz указанного фермента был интегрирован в геном штамма P. pastoris GS115 под контролем промотора глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы . Для амплификации гена adtz сконструировали олигонуклеотидные последовательности, к 5´-концу которых добавили специфические сайты рестрикции HindIII и NotI. После получения на основе вектора pPIG-1 плазмиды pPIG-ADTZ, содержащей ген adtz , ее линеаризовали посредством расщепления эндонуклеазой рестрикции ApaI и методом электропорации трансформировали клетки реципиентного штамма P. pastoris GS115. Полученные трансформанты дрожжевых клеток отбирали на среде Yeast Extract-Peptone-Dextrose (YPD) с антибиотиком. Вставку целевого гена подтверждали с помощью ПЦР-амплификации, рестрикционным анализом и секвенированием по Сэнгеру. В результате получили 54 трансформанта штамма P. pastoris GS115, содержавшие вставку целевого гена adtz , и среди них отобрали наиболее активный продуцент - клон ADTZ-14 (выход общего внеклеточного белка 2,1 мг/мл). Секретируемый этим клоном рекомбинантный фермент ADTZ представлял собой мономерный белок с молекулярной массой 78±3 кДа, обладающий высокой аффинностью к афлатоксину В1 (АФВ1). Сохранение функциональных свойств полученного белка было подтверждено экспериментами по оценке его способности деградировать АФВ1 при кратковременной и длительной инкубации. Так, под воздействием ADTZ концентрация АФВ1, добавленного в бесклеточную культуральную жидкость (КЖ) клона ADTZ-14, снижалась на 14 % уже через 2 ч инкубации при 40 °С. После более длительной инкубации при 30 °С содержание добавленного АФВ1 (5 мг/мл) в бесклеточной КЖ было на 50 % ниже, чем в контроле (КЖ нетрансформированного штамма P. pastoris GS115), через 3 сут, а через 5 сут инкубации в тех же условиях деградация токсина достигала 80 %. Полученные данные свидетельствуют о достаточно высоком биотехнологическом потенциале нового продуцента рекомбинантного белка ADTZ и целесообразности дальнейших исследований по созданию на его основе ферментного препарата для деконтаминации растениеводческой продукции, загрязненной АФВ1.
Бесплатно
Статья научная
У растений-регенерантов люцерны клейкой ( Medicago glutinosa L.), выделенных по оптимизированной схеме (с выявлением сомаклональной изменчивости), определили устойчивость к нефтезагрязнениям. Состояние растений оценивали по выживаемости и приросту за 56 сут. Среди регенерантов 20 % растений оказались хуже контроля, у 65 % — показатели не отличались от таковых у исходной формы, у 15 % — были выше, чем в контроле и у остальных растений-регенерантов. Растения-регенеранты в большей степени способствовали очищению почвы от нефтезагрязнений по сравнению с контролем (растениями, выращенными из семян).
Бесплатно
Краткое сообщение
Разрабатывали регламент отбора регенерантов ярового рапса на селективных питательных средах, содержащих нистатин. Отобранные на селективной среде растения-регенеранты проверяли на устойчивость к нистатину, учитывая укореняемость микрочеренков и частоту кал-лусообразования. В полевых и лабораторных условиях проводили энтомологическую оценку устойчивости (восприимчивости) полученных растений рапса к вредным насекомым.
Бесплатно
Статья научная
Чума мелких жвачных (ЧМЖ, peste des petits ruminants) - высококонтагиозная, остро или подостро протекающая вирусная болезнь овец и коз, характеризующаяся язвенными поражениями слизистой оболочки ротовой полости, лихорадкой, поражением лимфоидной системы, развитием пневмонии, геморрагическим гастроэнтеритом (A. Diallo с соавт., 1989; T.M. Ismail с соавт., 1995). Из-за высокой заболеваемости (50-100 %) и смертности (50-90 %) ЧМЖ относится к числу опасных заболеваний, наносящих значительный экономический ущерб (R.A. Kock с соавт., 2015). Возбудитель болезни - вирус ЧМЖ (род Morbillivirus , сем. Paramyxoviridae ) антигенно связан с другими морбилливирусами (G. Libeau с соавт., 2014). Степень проявления клинических признаков заболевания зависит от линии вируса ЧМЖ, вида, породы, иммунного статуса животных. Поэтому окончательный диагноз должен быть подтвержден в лаборатории. Для диагностических и мониторинговых серологических исследований предпочтение отдается технологичному и чувствительному методу иммуноферментного анализа (ИФА)...
Бесплатно
Статья научная
Вирус африканской чумы свиней (АЧС, African swine fever virus, ASFV) - крупный ДНК-содержаний вирус, единственный представитель семейства Asfarviridae. Вирус АЧС обладает разнообразными механизмами уклонения от иммунной системы хозяина, что становится препятствием для создания средств защиты от болезни. Один из способов иммунного уклонения, используемых вирусом, - мимикрия Toll-подобных рецепторов (TLR) иммуномодулирующими белками. Иммуномодулирующие белки вируса АЧС можно рассматривать как потенциально ценные инструменты для понимания патогенеза заболевания и создания средств борьбы с ним. Так, белок рI329L служит антагонистом и ингибитором сигнального пути TLR3, уменьшающим интерфероновый ответ. Белок рI329L ингибирует TLR3-опосредованную активацию NF-кВ и индукцию INF-b через активацию TLR3 с его лигандом - вирусной ДНК, РНК и poly(I:C). Удаление этого белка из ASFV служит рациональным подходом к разработке ослабленной вирусвакцины. Следовательно, I329L представляет собой вирусный антагонист TLR3, что негативно отражается на интерфероновом противовирусном ответе хозяина. Целью настоящей работы было получение клеточной линии CHO (клетки яичника китайского хомячка), стабильно экспрессирующей рекомбинантный белок I329L ASFV. Нами сконструирована плазмида pBMN-I329-his, несущая полноразмерный ген I329L ASFV с полигистидиновой меткой (His-tag) на C-конце. При помощи электропорации и культивирования в среде с антибиотиком пуромицином была получена стабильная клеточная линия CHO-I329L-His, несущая рекомбинантную плазмиду pBMN-I329- his. Встраивание гена I329L в геном клеток выявляли в ПЦР с геноспецифическими праймерами с последующим нуклеотидным секвенированием, используя в качестве матрицы ДНК, выделенную из клеток CHO-I329L-His. С помощью иммуноблотинга подтверждено наличие белка I329L в лизате клеток. Размер рекомбинантного белка составлял 55 кДа при расчетной молекулярной массе 35 кДа. Последовательное дегликозилирование целевого белка эндогликозидазами PNGase и Endo H приводило к увеличению его электрофоретической подвижности и детектированию спейсцифических полос ~37 и ~35 кДа. Этот факт подтверждает высокую степень гликозилирования целевой молекулы, что приводит к меньшей электрофоретической подвижности. Дополнительно показано, что рекомбинантный белок I329L взаимодействовал с гипериммунными сыворотками против штамма Ставрополь 01/08 ASFV, что свидетельствовало об его аутентичности вирусному белку. Полученная стабильная клеточная линия CHO-I329L-His депонирована в музей клеточных культур Федерального исследовательского центра вирусологии и микробиологии и может быть использована для изучения иммуномодулирующих локусов ASFV.
Бесплатно
Статья научная
Олигомеры хитина и хитозана влияют на рост и развитие растений и способны индуцировать их устойчивость к заражению фитопатогенами, что определяет интерес к получению и использованию этих соединений. Влияние олигомеров хитозана на растение непосредственно зависит от степени их деацетилирования, но при гидролизе полимера или химическом синтезе трудно получить соединения необходимой структуры. Такие задачи могут быть решены в процессе биосинтеза хитоолигосахаридов, когда используются ферменты с определенной специфичностью. Избирательная способность хитоолигосахариддеацетилазы (КФ 3.5.1.-) почвенных ризобий осуществлять монодеацетилирование хитоолигосахаридов по терминальному положению обусловливает интерес к изучению возможности использования этого фермента для получения таких соединений. В настоящей работе нами предложены подходы для синтеза монодеацетилированной хитопентаозы (тетра-N-ацетилхитопентаозы) с помощью фермента хитоолигосахариддеацетилазы бактерий Mesorhizobium loti. При гетерологичной экспрессии гена nodB, кодирующего хитоолигосахариддеацетилазу M. loti CIAM1803, в штаммах Escherichia coli XL1-Blue-MRF' и SHuffle express с помощью модифицированного вектора pOPE101mod -nodB с удаленной последовательностью pelB нам удалось получить фермент в растворимом состоянии. При этом количество растворимого фермента было выше в случае штамма SHuffle express, специально разработанного для обеспечения правильного формирования дисульфидных связей в синтезируемых белках. Изучение свойств фермента, очищенного на Ni-NTA агарозе, показало его способность деацетилировать пента-N-ацетилхитопентаозу по терминальному положению. Масс-спектрометрический анализ подтвердил использование практически всего субстрата для получения деацетилированной тетра-N-ацетилхитопентаозы. Были разработаны методы разделения и очистки деацетилированных хитоолигосахаридов с помощью ионообменной хроматографии с последующим обессоливанием. Синтез терминально N-деацетилированных олигомеров хитозана может быть необходимым этапом при получении их конъюгатов с биологически активными соединениями.
Бесплатно
Статья научная
Определяли функциональную активность нуклеотидных последовательностей консервативного промотора K2.10, контролирующего ген белка промежуточных филаментов кератина шерсти (II тип) у овец. Осуществляли микроинъекции в пронуклеусы зигот мышей генетической конструкции, содержащей ген улучшенного флуоресцирующего в зеленой области спектра белка медузы Aequorea victoria, под контролем кератинового промотора овец K2.10 длиной 730 п.н. Исследовали экспрессию репортерного белка в волосяном покрове и дифференцирующихся клетках коркового вещества волосяного стержня шести трансгенных мышей. Оценивали характер наследования трансгена у мышей в F1 и F2.
Бесплатно
Статья научная
Использование препаратов на основе безопасных для окружающей среды белковых элиситоров устойчивости растений к болезням может стать приемлемой альтернативой синтетическим пестицидам-ксенобиотикам, поскольку в естественных условиях такие элиситоры разлагаются до безвредных природных аминокислот. Этот подход также существенно снизит риск возникновения резистентности патогенов к средствам защиты растений. Ранее нами были выделены и исследованы бактериальные белки-элиситоры MF2 и MF3, способные индуцировать защитные реакции у широкого круга растений к вирусным и грибным патогенам. Белок MF2 размером 7,2 кДа выделен из Bacillus thuringiensis . Его первичная структура оказалась в высокой степени гомологичной аминокислотной последовательности бактериальных белков холодового шока CspD. Другой белок, MF3 (16,9 кДа) - пептидил-пролил цис/транс-изомераза FKBP типа, выделен из Pseudomonas fluo-rescens . В настоящей работе впервые был получен состоящий из двух элиситоров химерный белок MF2/MF3 и показана его защитная активность в патосистеме табак ( Nicotiana tabacum L.)-вирус табачной мозаики (ВТМ, семейство Virgaviridae , род Tobamovirus , вид Tobacco mosaic virus ). Также впервые установлено, что защитная активность MF2/MF3 не уступает активности смеси индивидуальных белков, взятых в эквивалентных концентрациях. Нашей целью было получение химерного белка MF2/MF3 методом гетерологичной экспрессии в Escherichia coli , оценка его способности индуцировать устойчивость к вирусу табачной мозаики, а также сравнение защитной активности полученного рекомбинантного элиситора с активностью индивидуальных элиситорных белков MF2 и MF3 и их смеси. Белок MF2/MF3, представлявший собой структуру из двух доменов, в которой элиситор MF2 был присоединен к N-концевому участку MF3 через полиаланиновый линкер (AAALIAA), получили на основе конструкции, созданной с использованием классической и Overlap-ПЦР. Рекомбинантный MF2/MF3 экспрессировался трансформированными клетками Escherichia coli Rosetta в виде растворимого белка массой около 25 кДа и был очищен до гомогенного состояния методом металл-аффинной хроматографии. Для оценки антивирусной активности химерного белка MF2/MF3 и сравнения его защитного эффекта с эффектом индивидуальных белков и их смеси использовали биотест с прединокуляционной обработкой отделенных от растения листьев табака некрозообразующего сорта Xanthi NN, которые затем заражали ВТМ. Растения выращивали в климатической камере (PGV 36, «Conviron», Канада) до стадии 3-5 настоящих листьев, в опытах использовали листья 3-го или 4-го яруса. Перед инокуляцией изолированные листьев обрабатывали препаратами химерного MF2/MF3 белка, индивидуальных белков (либо MF2, либо MF3) или их смеси. При этом на одну половинку листа наносили указанные препараты (5 капель по 10 мкл, 10 листьев на каждый вариант обработки), на другую половинку - соответствующий контроль. На следующий день листья инокулировали ВТМ. В первой серии экспериментов проверяли, сохранили ли препараты, полученные с помощью гетерологичной экспрессии свою целевую активность. Поэтому на половинки листьев наносили белки MF2/MF3, MF2, или MF3, а контрольные половинки листьев обрабатывали дистиллированной водой. Во второй серии опытов, целью которых было сравнение защитной активности химерного элиситора с каждым из индивидуальных элиситорных белков, на одну половинку листа наносили MF2/MF3, на вторую - MF2 или MF3. Наконец, в третьей серии экспериментов сравнивали защитный эффект химерного элиситора MF2/MF3 с эффектом смеси MF2 и MF3 после обработки половинок листьев MF2/MF3 и нанесения на их контрольные половинки смеси элиситорных белков. Кроме того, в каждую серию экспериментов включали вариант, в котором на обе половинки 5 листьев наносили капли дистиллированной воды, после чего листья заражали ВТМ (необработанный контроль). Было показано, что полученный химерный элиситор а также рекомбинантные MF2 и MF3 обладает высокой защитной активностью против ВТМ. При этом противовирусная активность элиситора MF2/MF3 приблизительно в 1,5 раза превышала активность каждого из белков. Сравнение уровней защитного эффекта смеси индивидуальных элиситоров и белка MF2/MF3 не выявило между ними статистически значимых различий. Таким образом, химерный MF2/MF3 обладал такой же целевой активностью, как и смесь MF2 и MF3. Эти результаты свидетельствуют о возможности использования вместо смеси элиситоров MF2 и MF3 рекомбинантного элиситора MF2/MF3, получение которого более технологично, чем приготовление смеси, требующее выращивания штаммов-продуцентов каждого из индивидуальных белков и их раздельного выделения.
Бесплатно
Статья научная
Малочисленный вид европейский бизон ( Bison bonasus ), или зубр, находится под угрозой исчезновения. Технология получения эмбрионов in vitro с использованием яйцеклеток коров и семени зубра может стать эффективным инструментом сохранения генетических ресурсов вида и их рационального использования в фундаментальных исследованиях по физиологии развития и для создания новых селекционных форм животных. Однако методы получения эмбрионов in vitro с участием вышеуказанных половых клеток в литературе не описаны. В настоящей работе впервые была предпринята попытка оплодотворения яйцеклеток коров спермой зубра и оценка их дальнейшего эмбрионального развития in vitro с использованием протокола IVM (in vitro maturation, созревание in vitro)/IVF (in vitro fertilization, оплодотворение in vitro)/IVC (in vitro culture, культивирование in vitro), применяемого для получения эмбрионов крупного рогатого скота ( Bos taurus ). Источником половых клеток самок служили яичники коров, отобранные после убоя. Ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) выделяли методом рассечения видимых фолликулов. ОКК культивировали группами по 25-35 ооцитов в 500 мкл модифицированной среды ТС-199 под слоем легкого минерального масла («Sigma», США) в течение 24 ч. Созревшие яйцеклетки переносили в среду оплодотворения. Замороженную эпидидимальную сперму зубра размораживали и обрабатывали методом «swim-up». Созревшие ооциты коров культивировали совместно cо сперматозоидами в среде Fert-TALP в течение 18 ч, после чего их переносили в эмбриональную среду и культивировали до стадии бластоцисты. В качестве контроля часть яйцеклеток коров культивировали с эякулированным семенем быка. Результативность оплодотворения спермой обоих видов оценивали по характеру взаимодействия между исходными половыми клетками, а также по компетенции оплодотворенных яйцеклеток к раннему эмбриональному развитию. Доля ооцитов с признаками полиспермии была выше после оплодотворения спермой зубра, чем после оплодотворения бычьем семенем: соответственно 21,6 и 8,5 % (P
Бесплатно
Статья научная
Республика Саха (Якутия) - один из основных оленеводческих регионов Российской Федерации. Из четырех утвержденных пород северного оленя ( Rangifer tarandus ) в республике разводят три - эвенскую, эвенкийскую и чукотскую (харгин). Многолетнее снижение поголовья домашних северных оленей в настоящее время приостановлено, но для сохранения популяции и нивелирования неблагоприятных последствий сокращения численности необходимы современные подходы для оценки генетического разнообразия. Наиболее востребован для этих целей анализ однонуклеотидных полиморфизмов (single nucleotide polymorphism, SNP) с помощью ДНК-микроматриц (ДНК-чипов). В настоящей работе с использованием Bovine SNP50 BeadChip проведено генотипирование и дана популяционно-генетическая характеристика трех пород домашнего северного оленя, разводимых на территории Республики Саха (Якутия). Биологическим материалом для исследований служили образцы ткани уха животных эвенской (EVN, n = 8), эвенкийской (EVK, n = 11) и чукотской (харгин) пород (CHU, n = 7). Программное обеспечение PLINK 1.07 применяли для проведения контроля качества генотипирования. Для статистической обработки данных использовали программное обеспечение PLINK 1.07, Admixture 1.3, R пакеты diveRsity и VennDiagram с последующей визуализацией в R пакетах pophelper и ggplot2. По результатам контроля качества для дальнейшего анализа было отобрано 512 полиморфных SNP. Анализ диаграммы Венна показал, что олени эвенской и эвенкийской пород имели максимальное число уникальных полиморфизмов (14 SNP). У оленей чукотской породы детектировали 11 таких SNP. При расчете основных внутрипопуляционных параметров оказалось, что представители чукотской породы характеризуются более высоким генетическим разнообразием (Ho = 0,180±0,011, He = 0,156±0,008, Ar = 1,488±0,022), а также более высоким избытком гетерозигот (FIS = -0,124) по сравнению с эвенкийской (Ho = 0,161±0,009, He = 0,153±0,008, Ar = 1,487±0,020, FIS = -0,047) и эвенской (Ho = 0,164±0,010, He = 0,149±0,008, Ar = 1,471±0,021, FIS = -0,089) породами. Результаты многомерного шкалирования (MDS) и расчета попарных генетических дистанций (FST) показали, что наибольшей генетической близостью характеризуются олени эвенской и эвенкийской пород. Адмикс-анализ выявил высокую степень генетической обособленности каждой из исследуемых пород. Вместе с тем среди CHU и EVK были обнаружены особи, имеющие смешанное генетическое происхождение, близкое к EVN. Таким образом, мы успешно использовали ДНК-чип, разработанный для крупного рогатого скота, при генетической дифференциации пород северного оленя. Полученные данные найдут применение в разработке программ сохранения и рационального использования этого важнейшего для человека вида животных.
Бесплатно
Статья научная
Важнейшие признаки клубеньковых бактерий (ризобий), по которым проводится отбор хозяйственно ценных штаммов, - симбиотическая эффективность (способность повышать массу инокулированных растений-хозяев благодаря интенсивной фиксации молекулярного азота) и конкурентоспособность (способность инокулировать растения в присутствии других штаммов этого же вида ризобий). С помощью ПЦР-анализа штаммов ризобий люцерны ( Sinorhizobium meliloti ) различного происхождения мы впервые показали полиморфизм природных популяций по генам Smc03879, или phbA («негативный регулятор эффективного симбиоза», кодирует синтез поли-b-гидроксибутирата), и Sma0907, или cmp-107 (участвует в конкуренции за образование клубеньков). В популяции, обитающей в бедной солончаковой почве (Уральская область, Казахстан), ген phbA выявлен у 100 % штаммов, тогда как в популяции из богатой черноземной почвы Тернопольской области Украины - лишь у 82,2 % штаммов. Еще более низкая встречаемость гена phbA (30,8 %) характерна для штаммов из клубеньков люцерны, собранных в Тернопольской области. Наблюдаемый полиморфизм может отражать низкую адаптивную значимость конверсии С-соединений в поли-b-гидроксибутират для штаммов ризобий из Тернопольской области по сравнению со штаммами из Уральской области. Участие гена phbA в контроле симбиотической эффективности подтверждается тем, что для гена nifH, который кодирует структуру малой субъединицы нитрогеназы, но не влияет на интенсивность ее синтеза, различий в показателях популяционного полиморфизма между штаммами двух популяций выявлено не было. Отсутствие во всех изученных популяциях полиморфизма по гену Smb21375, или eff-798, может быть связано с тем, что кодируемый им АВС-транспортер необходим для переноса в бактериальную клетку широкого спектра питательных веществ, получаемых как от растения-хозяина, так и из почвы. Высокая встречаемость эффективных симбионтов среди штаммов, лишенных гена phbA, указывает на возможность использования молекулярных зондов, содержащих этот ген, для отбора практически значимых генотипов ризобий, способных обеспечивать растения-хозяина значительными количествами фиксированного азота.
Бесплатно
